U praksi laboratorijska dijagnostika zaraznih bolesti, ponekad postoji potreba za određivanjem antitijela ne općenito na patogen, već na određene njegove proteine ​​(antigene), odnosno spektar specifičnih antitijela. Ako se u tu svrhu koristi metoda enzimskog imunosorbentnog testa, tada je u tom slučaju potrebno prvo izolirati i pročistiti potrebne antigene iz kulture patogena. Dobijeni proteini se nanose odvojeno na čvrstu fazu. U slučaju upotrebe ploče sa 96 jažica - jedna vrsta antigena u svakoj jažici. Zatim se indirektnom metodom određuju specifična antitijela.

Po prisustvu pozitivne reakcije u jažici sa jednim ili drugim antigenom, može se suditi o prisustvu odgovarajućih specifičnih antitela. Ovu vrstu enzimskog imunosorbentnog testa nude proizvodne firme, međutim, zbog većeg sadržaja informacija i jednostavnosti samog istraživanja, metoda imunoblotiranja (Western blot) postala je široko rasprostranjena.

Imunološki bloting omogućava određivanje antitijela u krvnom serumu istovremeno i istovremeno, diferenciranih na sve dijagnostički značajne proteine ​​patogena. U prijevodu s engleskog Western blot znači zapadni prijenos (doslovno - blotiranje). Istorija ovog neobičnog pojma je sljedeća.

Naučnik po imenu E. Southern je 1975. godine prvi predložio metodu za prijenos elektroforetski odvojenih fragmenata DNK iz gela na membranu. Prema autoru, metoda je nazvana Southern blot, što znači „južni transfer“. Metodu prijenosa RNA molekula, pak, stručnjaci su nazvali Northern blot - "sjeverni prijenos". Isprva iz šale, a onda se ovaj naziv fiksirao u službenoj naučnoj literaturi.

G. Toubin je 1979. objavio rezultate prvih eksperimenata na proteinskom blotingu. U nastavku tradicije "geografskih" metoda imenovanja za prijenos bioloških makromolekula, ova metoda je postala poznata kao "zapadni" prijenos - Western blot.

U prvoj fazi ove metode vrši se elektroforetsko odvajanje mješavine proteina patogena u poliakrilamidnom gelu u prisustvu natrijum dodecil sulfata (SDS). SDS, budući da je surfaktant, jednoliko obavija proteinske molekule i svima im daje negativan naboj približno jednake veličine. Stoga se molekuli kreću u električnom polju u jednom smjeru, a brzina kretanja ovisi samo o veličini molekula (molekularnoj težini) proteina.

Kao rezultat elektroforetskog postupka dobiva se gel ploča u čijoj se debljini nalaze proteini u obliku odvojenih tankih linearnih zona. U smjeru kretanja razdvojeni su sljedećim redoslijedom: bliže startu su proteini velike molekularne težine, reda veličine 120-150 kDa, a proteini mase 5-10 kDa su napredovali do cilja. linija. U drugom koraku, sloj gela se nanosi na nitrocelulozni sloj i struktura se postavlja između elektroda DC napajanja. Pod djelovanjem električnog polja, proteini teku iz poroznog gela do gušće membrane, gdje su čvrsto fiksirani.

Nastala mrlja se tretira otopinom za blokiranje koja sadrži antigenski indiferentne proteine ​​i/ili nejonske deterdžente (Tween 20), koji blokiraju mjesta na membrani bez antigena. List membrane se zatim reže na uske trake tako da svaka traka sadrži sve antigene frakcije. Opisane korake izvodi proizvođač.

Komercijalni test sistemi za određivanje antitela imunološkim blotingom sadrže mrlje (trake ili trake) spremne za analizu. Korisnik indirektnom metodom provodi određivanje cjelokupnog spektra specifičnih antitijela na proteine ​​patogena. Kao hromogen za provođenje kolorne (enzimske) reakcije koristi se topiva bezbojna tvar čiji produkt dobiva boju, postaje nerastvorljiv i taloži se (taloži) na nitrocelulozi.

Kao rezultat uzastopnog provođenja imunoloških i enzimskih reakcija u prisustvu antitijela na proteine ​​patogena u uzorku testa, na mrlji se pojavljuju tamne poprečne pruge, čija se lokacija nalazi u zoni određenih proteina patogena. . Svaka takva traka ukazuje na prisustvo specifičnih antitela na odgovarajući antigen. Rezultat studije provedene metodom imunološkog blotinga izdaje se u obliku liste antitijela na specifične proteine ​​patogena. Na primjer: "antitijela na proteine ​​p17 i p24 su identificirana."

Nakon razvoja, nitrocelulozne mrlje mogu se dugo čuvati suhe. Međutim, intenzitet boje je značajno oslabljen. Mokre mrlje se mogu fotografisati ili ubrizgati pomoću skenera grafička slika u memoriju personalnih računara. Posebni kompjuterski programi omogućavaju vam da obradite dobijene rezultate i brzo pratite dinamiku spektra antitela tokom dinamičkog posmatranja

Prepoznatljive karakteristike:

• Set reagensa "MPBA - Blot - HIV-1, HIV-2" sadrži prečišćeni lizat virusnih proteina HIV-a 1 i peptid - antigenski determinirani gp36 HIV-2;
• Omogućava otkrivanje antitela na HIV-1, HIV-1 grupu O, HIV 2 na jednoj traci;
• Jednostavna procedura za pripremu i provođenje analiza;
• Interna kontrola kvaliteta reakcije *
• Maksimalna brzina analize (3 sata);
• Mala zapremina uzorka za ispitivanje - 20 μl;
• Ne zahtijeva dodatnu opremu za istraživanje;
• Kvalitet kompleta je zagarantovan upotrebom ruskih i međunarodnih referentnih materijala **

* Interna kontrola kvaliteta je obezbeđena prisustvom:

• interne kontrolne trake, omogućavaju kontrolu dodavanja uzorka seruma ili plazme;
• kontrolni negativni serum (K-);
• kontrolni pozitivan serum (K +), koji omogućava identifikaciju traka otkrivenih na traci;
• kontrola slabo pozitivnog seruma (K + cl), što omogućava kontrolu osjetljivosti kompleta reagensa.

**Osiguranje kvaliteta:

Karakteristike seta reagensa "MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2" utvrđene su testiranjem uzoraka slučajnog uzorka donora, pacijenata sa dijagnozom HIV infekcija, komercijalni paneli za serokonverziju, standardni paneli i uzorci sa komponentama koje “potencijalno ometaju detekciju”.

Set reagensa ne daje lažno pozitivne rezultate u ispitivanju standardnih panel seruma koji ne sadrže antitela na HIV 1,2 i HIV-1 antigen („Standard AT (-) HIV“, br. FSR 2007/00953 od 25.10. .2007). Specifičnost je 100%.

Dijagnostička specifičnost utvrđena je proučavanjem slučajnog uzorka od 200 davalaca iz različitih centara krvi i klinika kod kojih je prethodno potvrđeno odsustvo HIV-1, HIV-2 infekcije. Specifičnost u istraživanju slučajnog uzorka donora bila je 100%;

Specifičnost kompleta reagensa utvrđena je ispitivanjem 250 uzoraka, uključujući uzorke seruma ili plazme dobijene od trudnica, hospitalizovanih pacijenata sa hepatitisom C i E, i uzorke sa "potencijalno interferirajućim" komponentama. Kada se koristi set "MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2" za ove uzorke, nisu pronađeni lažno pozitivni rezultati.

Dijagnostička osjetljivost je određena korištenjem:
- uzorci plazme sa panela Boston Biomedica, Inc HIV-1 (WWRB 301) iz različitih regiona koji sadrže različite podtipove HIV-1: grupa M (podtipovi A, B, C, D, E, F) i grupa O; osjetljivost kompleta reagensa bila je 100%;

Osetljivost kompleta reagensa određena je u studiji međunarodnih panela za serokonverziju Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), kat. nrs. TRN 903, TRN 904, TRN 909, TRN 912, TRN 916, TRN 917, TRN 918, TRN 919, TRN 921, TRN 923, TRN 924, TRN 927, TRN 928, TRN 932

Komplet reagensa detektuje antitela na HIV-1 u serumu standardnog panela koji sadrži antitela na HIV-1 ("Standard AT (+) HIV-1", br. FSR 2007/00953 od 25.10.2007), detektuje antitela na HIV -2 u serumu standardne ploče koja sadrži antitela na HIV-2 ("Standard AT (+) HIV-2", br. FSR 2007/00953 od 25.10.2007). Osetljivost - 100%.

Potvrda o registraciji br. FSR 2010/07958 od 13.07.2011. (važenje nije ograničeno)

Sastav:

• Imunosorbent. Trake sa bijele nitrocelulozne membrane sa pojedinačnim HIV-1 proteinima (gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17) adsorbiranim na njih metodom elektrotransfera i nanesenim na traku sa sintetičkim HIV-2 peptidom, analog gp36 proteina i anti-humani IgG (interna kontrola) - 18 kom;
• K- - kontrolni negativni serum. Ljudski krvni serum, koji ne sadrži antitela na HIV-1,2, HCV, HIV antigen, HBsAg, inaktivira se zagrevanjem na 560C; bistra svijetložuta tekućina - 1 tuba (0,08 ml). Sadrži konzervanse: timerosal i natrijum-azid;
• K + - kontrolni pozitivni serum. Ljudski krvni serum koji sadrži antitela na HIV-1,2 (titar ne manji od 1:10000), ne sadrži HBsAg, HIV antigen, antitela na HCV, inaktiviran zagrevanjem na 560C; bistra svijetložuta tekućina - 1 tuba (0,08 ml) Sadrži konzervanse: timerosal i natrijum-azid;
• K + sl - slabo pozitivan kontrolni serum. Ljudski krvni serum koji sadrži antitela na HIV-1,2 (titar ne veći od 1:200), bez HBsAg, HIV antigena, antitela na HCV, inaktiviran zagrevanjem na 560C; bistra svijetložuta tekućina - 1 tuba (0,08 ml). Sadrži konzervanse: timerosal i natrijum-azid;
• RROKk (x10) - rastvor za razblaživanje uzoraka i konjugata. Koncentrat - Tris pufer koji sadrži prethodno tretirani normalni kozji serum; neprozirna siva tečnost - 1 boca (10 ml). Sadrži konzervans: timerosal;
• PRk (x20) - otopina za pranje. Koncentrat - Tris pufer koji sadrži Tween-20; prozirna bezbojna tečnost - 1 boca (70 ml). Sadrži konzervans: timerosal;
• Konjugirati. Kozja anti-humana IgG antitijela konjugirana na alkalnu fosfatazu; bistra, bezbojna tečnost - 1 tuba (0,06 ml);
• Supstrat (otopina za bojenje). Rastvor 5-bromo-4-fluoro-indolil fosfata (BCIP) i nitro plavog tetrazolija (NBT); bistra svijetložuta tekućina - 1 boca (50 ml);
• Imuni blotting prah. Obrano mleko u prahu - amorfni beli ili svetlo žuti prah - 5 pakovanja x 1g;
• Tanjir sa poklopcem za postavljanje reakcije - 2 komada;
• Plastična pinceta - 1 kom.

ELISA u čvrstoj fazi - varijanta testa, kada se jedna od komponenti imunološkog odgovora (antigen ili antitijelo) sorbira na čvrstom nosaču, na primjer, u jažice polistirenskih ploča. Komponente se identifikuju dodavanjem obeleženih antitela ili antigena. Ako je rezultat pozitivan, boja hromogena se mijenja. Svaki put nakon dodavanja sljedeće komponente, nevezani reagensi se uklanjaju iz jažica ispiranjem,

Prilikom određivanja antitijela (lijeva slika), u jažice ploča sa sorbiranim antigenom uzastopno se dodaju krvni serum pacijenta, antiglobulinski serum obilježen enzimom i supstrat/hromogen za enzim.

II. Prilikom određivanja antigena (desna slika), u jažice se unosi antigen s adsorbiranim antitijelima (na primjer, krvni serum sa željenim antigenom), dijagnostički serum protiv njega i sekundarna antitijela (protiv dijagnostičkog seruma) označena enzimom, a zatim se doda supstrat/hromogen za enzim.

Competitive ELISA za određivanje antigena: ciljni antigen i enzimski obilježeni antigen takmiče se jedni s drugima za vezivanje ograničenog broja antitijela imunološkog seruma.

Drugi test je kompetitivni ELISA za određivanje antitela: ciljna antitela i enzimski obeležena antitela se međusobno takmiče za antigene adsorbovane na čvrstoj fazi.

Imunobloting- visoko osjetljiva metoda za detekciju proteina zasnovana na kombinaciji elektroforeze i ELISA ili RIA. Imunobloting se koristi kao dijagnostička metoda za HIV infekciju itd.

Antigeni patogena se odvajaju elektroforezom u poliakrilamidnom gelu, zatim se prenose iz gela na aktivirani papir ili nitroceluloznu membranu i razvijaju pomoću ELISA. Firme proizvode takve trake sa upijanjem antigena. Na ove trake se nanosi pacijentov serum. . Zatim, nakon inkubacije, nevezana antitijela pacijenta se ispiru i nanosi se serum protiv humanih imunoglobulina označenih enzimom. . Kompleks [antigen + pacijentovo antitijelo + anti-humano Ig antitijelo] formiran na traci se otkriva dodavanjem hromogenog supstrata koji mijenja boju pod djelovanjem enzima.

52. Interferoni, priroda. Načini dobijanja i upotrebe.

Interferon pripada važnim zaštitnim proteinima imunog sistema. Otkriveno je proučavanjem interferencije virusa, odnosno fenomena kada životinje ili ćelijske kulture zaražene jednim virusom postanu neosjetljive na infekciju drugim virusom. Ispostavilo se da je smetnja posljedica nastalog proteina, koji ima zaštitno antivirusno svojstvo. Ovaj protein se zvao interferon.

Interferon je porodica glikoproteinskih proteina koje sintetišu ćelije imunog sistema i vezivnog tkiva. U zavisnosti od toga u kojim ćelijama se sintetiše interferon, razlikuju se tri tipa: α, β i γ-interferoni.

Alfa interferon proizveden od leukocita, a naziva se leukocit; beta interferon naziva se fibroblastnim, jer ga sintetiziraju fibroblasti - ćelije vezivnog tkiva, i gama interferon- imunski, jer ga proizvode aktivirani T-limfociti, makrofagi, prirodne ćelije ubice, odnosno imune ćelije.

Interferon se konstantno sintetizira u tijelu, a njegova koncentracija u krvi se održava na oko 2 IU/ml (1 međunarodna jedinica - ME je količina interferona koja štiti ćelijsku kulturu od 1 CPE 50 virusa). Proizvodnja interferona naglo se povećava kada je zaražena virusima, kao i kada je izložena induktorima interferona, na primjer, RNK, DNK, složenim polimerima. Takvi induktori interferona se nazivaju interferonogena.

Osim antivirusnog djelovanja, interferon ima i antitumorsku zaštitu, jer usporava proliferaciju (množenje) tumorskih stanica, kao i imunomodulatorno djelovanje, stimulira fagocitozu, prirodne stanice ubice, reguliše proizvodnju antitijela B stanicama, aktivira ekspresiju glavnih kompleks histokompatibilnosti.

Mehanizam djelovanja interferon je kompleksan. Interferon ne utiče direktno na virus izvan ćelije, već se vezuje za posebne receptore ćelija i utiče na proces reprodukcije virusa unutar ćelije u fazi sinteze proteina.

Upotreba interferona... Djelovanje interferona je efikasnije, što se ranije počinje sintetizirati ili ulazi u tijelo izvana. Stoga se koristi u profilaktičke svrhe kod mnogih virusnih infekcija, kao što je gripa, kao i kod terapeutske svrhe kod kroničnih virusnih infekcija kao što su parenteralni hepatitis (B, C, D), herpes, multipla skleroza itd. Interferon daje pozitivne rezultate u liječenju malignih tumora i bolesti povezanih sa imunodeficijencijom.

Interferoni su specifični za vrstu, odnosno ljudski interferon je manje efikasan za životinje i obrnuto. Međutim, ova specifičnost vrste je relativna.

Dobijanje interferona... Interferon se dobija na dva načina: a) inficiranjem ljudskih leukocita ili limfocita sigurnim virusom, usled čega inficirane ćelije sintetiziraju interferon, koji se zatim izolira i od njega se osmišljavaju pripravci interferona; b) genetski modifikovani - uzgojem u industrijskim uslovima rekombinantnih sojeva bakterija sposobnih za proizvodnju interferona. Obično koriste rekombinantne sojeve pseudomonas, Escherichia coli sa interferonskim genima ugrađenim u njihovu DNK. Genetski modifikovan interferon se naziva rekombinantnim. U našoj zemlji rekombinantni interferon je dobio službeni naziv "Reaferon". Proizvodnja ovog lijeka je po mnogo čemu efikasnija i jeftinija od leukocitnog.

Rekombinantni interferon je pronašao široku primjenu u medicini kao profilaktičko i terapeutsko sredstvo za virusne infekcije, neoplazme i imunodeficijencije.

Opis

Metoda određivanja Imunoblot.

Studijski materijal Krvni serum

Mogućnost kućne posjete

Antinukleinska antitijela su porodica autoantitijela koja se vezuju za ribonukleinske kiseline i njihove povezane proteine. Javljaju se kod više od 90% pacijenata sa difuznim bolestima vezivnog tkiva, a često se uočavaju i kod autoimunih bolesti jetre i niza drugih stanja. Do danas je okarakterisano oko 200 varijanti ove porodice autoantitijela, ali se ne mogu sve koristiti u kliničkoj praksi.

Imunoblot antinuklearnih antitela omogućava u jednom testu da se istovremeno proučava 15 glavnih tipova antinuklearnih antitela, što obezbeđuje diferencijalna dijagnoza glavne sistemske reumatske bolesti. Svaka vrsta autoantitijela otkrivena imunoblotom obično se opaža kod pacijenata s karakterističnom kliničkom slikom, stoga spektar autoantitijela omogućava ne samo dijagnosticiranje bolesti, već i utvrđivanje rizika od razvoja određenih kliničkih manifestacija.

Imunoblot antinuklearnih antitela preporučljivo je koristiti u drugoj fazi serološkog pregleda kada pozitivan rezultat drugi testovi koji ukazuju na prisustvo antinuklearnih antitela u serumu ispitivane osobe. Ovi testovi uključuju određivanje antinuklearnih antitela (ELISA skrining), detekciju antinuklearnog faktora (ANF) na Hep2 ćelijama (), antinuklearnih antitela i antitela na ekstrahovani nuklearni antigen (ENA,).

Metoda imunoblotiranja antinuklearnih antitijela u dijagnostici sistemskih reumatskih bolesti odlikuje se visokom kliničkom specifičnošću. Ali specifičnost antinuklearnih antitijela, čak i sa visokim titarima ANP (), nije uvijek moguće utvrditi, budući da određeni broj antinuklearnih antitijela i dalje ostaje neobilježen. Negativan rezultat imunoblota u ovom slučaju ne isključuje dijagnozu sistemskih reumatskih bolesti. Brojna antinuklearna antitijela mogu se otkriti korištenjem imunoblota - panela autoantitijela specifičnih za miozitis () i imunoblota - panela autoantitijela kod skleroderme ().

Književnost

1. Lapin S.V. Totolyan A.A. Imunološka laboratorijska dijagnostika autoimunih bolesti / Izdavačka kuća "Čelovek", Sankt Peterburg - 2010. 272 ​​str.
2. E. L. Nasonov, E. N. Aleksandrova Savremeni standardi za laboratorijsku dijagnostiku reumatskih bolesti. Kliničke smjernice/ BHM, M - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantitijela u autoimunim bolestima specifičnim za organ: Dijagnostička referenca / PABST, Drezden - 2011.300 str.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantitijela u sistemskim autoimunim bolestima: Dijagnostička referenca / PABST, Drezden - 2007.300 str.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Autoantibodies 2nd ed./ Elsevier Science - 2006.862 str.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Dijagnostički kriteriji u autoimunim bolestima / Humana Press - 2008.598 str.
7. Upute za komplet reagensa.

Priprema

Poželjno je izdržati 4 sata nakon posljednjeg obroka, nema obaveznih zahtjeva.

Indikacije za termin

Test je indiciran za dijagnozu i diferencijalnu dijagnozu sljedećih stanja:

• sistemski eritematozni lupus;
• subakutni kožni lupus i druge vrste kožnog lupusa;
• mješovita bolest vezivnog tkiva;
• Sjogrenov sindrom i pridružene bolesti;
• difuzna i lokalizovana sklerodermija, CREST sindrom;
• upalne miopatije (polimiozitis i dermatomiozitis);
• juvenilni kronični artritis;
• autoimuni hepatitis;
• primarna bilijarna ciroza i sklerozirajući holangitis;
• upotreba ovog testa je indikovana kada se otkriju visoki titri antinuklearnog faktora, antinuklearnih antitijela, antitijela na ekstrahirani nuklearni antigen, antitijela na DNK, antitijela na nukleozome i antifosfolipidna antitijela.

Interpretacija rezultata

Tumačenje rezultata testa sadrži informacije za ljekara koji prisustvuje i ne predstavlja dijagnozu. Informacije u ovom odjeljku ne mogu se koristiti za samodijagnozu i samoliječenje. Tačnu dijagnozu postavlja ljekar koristeći kako rezultate ovog pregleda, tako i potrebne podatke iz drugih izvora: anamnezu, rezultate drugih pregleda itd.

Jedinice mjere: kvalitativni test, rezultat se prikazuje u obliku "pronađeno" ili "nije pronađeno".

Kada se pronađe traka koja karakteriše prisustvo određene vrste antitela, intenzitet boje trake se dodatno opisuje brojem pluseva („križeva“) za svaku od identifikovanih vrsta antitela. Povećanje stepena pozitivnosti indirektno odražava sadržaj i afinitet autoantitijela.

Referentne vrijednosti: antitijela na Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kDa), SS-A (52 kDa), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENP-B, dsDNA, histon, nukleosom , Rebro P, AMA-M2, Jo-1 nije pronađeno.

Rezultat određivanja autoantitijela prikazan je u križevima za svaki odgovarajući antigen. Povećanje stepena seropozitivnosti indirektno odražava sadržaj i afinitet autoantitijela. U nastavku su date varijante rezultata procjene seropozitivnosti:

1. Nisu otkrivena antitijela.
2. +/- - granični rezultat;
3. + - nizak sadržaj autoantitijela na specifični antigen;
4. ++ - prosječan sadržaj autoantitijela na određeni antigen;
5. +++ - visok sadržaj autoantitijela na specifični antigen.

Glavne bolesti povezane s otkrivanjem antinuklearnih antitijela:

Imuno blotting(Western Blot, Western Blot)- kombinuje enzimski imunosorbentni test (ELISA) s preliminarnim elektroforetskim prijenosom virusnih antigena na nitroceluloznu traku (traku).

U ovom prekrasnom naučnom nazivu "blot" je najvjerovatnije preveden kao "mrlja", a "zapadna" - kao "zapadna" odražava smjer širenja ove "mrlje" na papiru s lijeva na desno, odnosno na geografskom karti ona odgovara smjeru od zapada prema istoku." Suština metode "imune blot" je da se reakcija imunosorbenta vezanog za enzim ne provodi sa mješavinom antigena, već s HIV antigenima, prethodno raspoređenim imunoforezom u frakcije locirane prema molekularnoj težini na površini nitroceluloze. membrana. Kao rezultat toga, glavni proteini HIV-a, nosioci antigenskih determinanti, distribuiraju se po površini u obliku odvojenih traka, koje se manifestuju tokom enzimske imunosorbentne reakcije.

Imunoblot uključuje nekoliko faza:

Priprema trake. Virus imunodeficijencije (HIV), prethodno pročišćen i razgrađen na sastavne komponente, podvrgava se elektroforezi, dok su antigeni koji su dio HIV-a razdvojeni po molekularnoj težini. Zatim, upijanjem (analogno istiskivanju viška mastila na upijaču), antigeni se prenose na traku nitroceluloze, koja sada sadrži spektar antigenskih traka nevidljivih za oko, što je karakteristično za HIV.

Uzorak istraživanja. Ispitni materijal (serum, plazma krvi pacijenta, itd.) se nanosi na nitroceluloznu traku, a ako u uzorku postoje specifična antitijela, onda se ona vezuju za striktno odgovarajuće (komplementarne) antigene trake. Kao rezultat naknadnih manipulacija, rezultat ove interakcije se vizualizira - čini vidljivim.

Interpretacija rezultata. Prisustvo traka u određenim područjima nitrocelulozne ploče potvrđuje prisustvo antitela na strogo definisane HIV antigene u ispitivanom serumu.

Traka A - Pozitivna kontrola

Bar B - Slabo pozitivna kontrola

Traka C - negativna kontrola

Traka D - Pozitivan uzorak (otkrivena antitijela na HIV-1)

Trenutno je imunološki blot (imunoblot) glavna metoda za potvrđivanje prisustva antitijela specifičnih za virus u ispitivanom serumu. U nekim slučajevima HIV infekcije, prije razvoja serokonverzije, specifična antitijela se efikasnije otkrivaju imunoblotiranjem nego ELISA. U istraživanju metodom imuno blotinga utvrđeno je da se antitijela na gp 41 najčešće otkrivaju u serumima oboljelih od AIDS-a, a otkrivanje p24 kod osoba koje su pregledane u profilaktičke svrhe zahtijeva dodatne studije na prisustvo HIV infekcije. Test sistemi za imunološki blot bazirani na genetski modifikovanim rekombinantnim proteinima pokazali su se specifičnijim od konvencionalnih sistema baziranih na pročišćenom virusnom lizatu. Kada se koristi rekombinantni antigen, ne formira se difuzna, već jasno izražena uska traka antigena, koja je lako dostupna za snimanje i evaluaciju.

Serumi osoba inficiranih HIV-1 pokazuju antitela na sledeće osnovne proteine ​​i glikoproteine ​​- proteini strukturne ovojnice (env) - gp160, gp120, gp41; jezgra (gag) - p17, p24, p55, kao i virusni enzimi (pol) - p31, p51, p66. Za HIV-2, tipična su antitela na env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - p68.

Među laboratorijske metode, neophodno za utvrđivanje specifičnosti reakcije, najpriznatije je detekcija antitela na proteine ​​omotača HIV-1 - gp41, gp120, gp160, i HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

SZO smatra pozitivnim serume u kojima su antitijela na bilo koja dva HIV glikoproteina otkrivena metodom imunološkog blotinga. Prema ovim preporukama, ako dođe do reakcije samo sa jednim od proteina ovojnice (gp 160, gp 120, gp 41) u kombinaciji ili bez reakcije s drugim proteinima, rezultat se smatra sumnjivim i preporučuje se ponovno testiranje pomoću komplet iz druge serije ili iz druge kompanije. Ako i nakon ovoga rezultat ostane sumnjiv, preporučuje se promatranje 6 mjeseci (studije nakon 3 mjeseca).

Prisustvo pozitivne reakcije sa p24 antigenom može ukazivati ​​na period serokonverzije, jer se antitijela na ovaj određeni protein ponekad pojavljuju prva. U tom slučaju se preporučuje, zavisno od kliničkih i epidemioloških podataka, da se studija ponovi sa uzorkom seruma uzetim najmanje 2 sedmice kasnije, a to je upravo slučaj kada su za HIV infekciju potrebni upareni serumi.

Pozitivne reakcije sa gag i pol proteinima bez reakcije sa env proteinima mogu odražavati ranu serokonverzivnu fazu i takođe mogu ukazivati ​​na HIV-2 infekciju ili nespecifičnu reakciju. Osobe sa takvim rezultatima nakon testiranja na HIV-2 ponovo se pregledaju nakon 3 mjeseca (unutar 6 mjeseci).