V praksi laboratorijska diagnostika nalezljivih bolezni, včasih je treba določiti protitelesa ne na splošno proti patogenu, temveč proti nekaterim njegovim beljakovinam (antigenom), to je spekter specifičnih protiteles. Če se v ta namen uporablja metoda encimskega imunosorbentnega testa, je v tem primeru treba najprej izolirati in očistiti potrebne antigene iz kulture patogena. Nastale beljakovine nanesemo ločeno na trdno fazo. V primeru uporabe plošče s 96 vdolbinicami - ena vrsta antigena v vsaki vdolbinici. Nato se s posredno metodo določijo specifična protitelesa.

Po prisotnosti pozitivne reakcije v vdolbinici z enim ali drugim antigenom lahko ocenimo prisotnost ustreznih specifičnih protiteles. Tovrstne sisteme encimsko vezanih imunskih testov ponujajo proizvodna podjetja, vendar se je zaradi večje informacijske vsebine in preprostosti same študije razširila metoda imunskega blotiranja (Western blot).

Imunski bloting omogoča določanje protiteles v krvnem serumu hkrati in hkrati, diferenciranih na vse diagnostično pomembne proteine ​​patogena. Prevedeno iz angleščine Western blot pomeni Western prenos (dobesedno - blotting). Zgodovina tega nenavadnega izraza je naslednja.

Znanstvenik z imenom E. Southern je leta 1975 prvi predlagal metodo za prenos elektroforetsko ločenih fragmentov DNK iz gela na membrano. Po mnenju avtorja je bila metoda imenovana Southern blot, kar pomeni »južni prenos«. Metodo prenosa molekul RNA pa so strokovnjaki poimenovali Northern blot - "severni prenos". Sprva v šali, nato pa se je to ime uveljavilo v uradni znanstveni literaturi.

G. Toubin je leta 1979 objavil rezultate prvih poskusov blotinga beljakovin. V nadaljevanju tradicije "geografskih" metod poimenovanja za prenos bioloških makromolekul je ta metoda postala znana kot "western" prenos - Western blot.

Na prvi stopnji te metode se izvede elektroforetska ločitev zmesi patogenih proteinov v poliakrilamidnem gelu v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata (SDS). SDS, ki je površinsko aktivna snov, enakomerno obdaja beljakovinske molekule in vsem daje negativni naboj približno enake velikosti. Zato se molekule gibljejo v električnem polju v eno smer, hitrost gibanja pa je odvisna le od velikosti molekule (molekulske mase) proteina.

Kot rezultat elektroforetskega postopka dobimo gelno ploščo, v debelini katere se nahajajo proteini v obliki ločenih tankih linearnih con. V smeri gibanja se ločijo v naslednjem vrstnem redu: bližje startu so proteini velike molekulske mase, približno 120-150 kDa, v cilj pa so napredovali proteini z maso 5-10 kDa. V drugem koraku se gelna plošča nanese na nitrocelulozno ploščo in struktura se vstavi med elektrode napajalnika DC. Pod delovanjem električnega polja se proteini iz poroznega gela pretakajo v gostejšo membrano, kjer so trdno fiksirani.

Nastali blot obdelamo z blokirno raztopino, ki vsebuje antigensko indiferentne proteine ​​in/ali neionske detergente (Tween 20), ki blokirajo mesta brez antigena na membrani. Membranski list se nato razreže na ozke trakove, tako da vsak trak vsebuje vse antigenske frakcije. Opisane korake izvede proizvajalec.

Komercialni testni sistemi za določanje protiteles z imunskim blotingom vsebujejo blote (trakove ali trakove), pripravljene za analizo. Uporabnik izvede določitev celotnega spektra specifičnih protiteles proti proteinom patogena z posredno metodo. Kot kromogen za izvedbo barvne (encimske) reakcije se uporablja topna brezbarvna snov, katere produkt pridobi barvo, postane netopen in se usede (obori) na nitrocelulozi.

Kot rezultat zaporednega izvajanja imunskih in encimskih reakcij v prisotnosti protiteles proti proteinom patogena v testnem vzorcu se na madežu pojavijo temne prečne črte, katerih lokacija se nahaja v območju določenih proteinov. patogen. Vsak tak pas kaže na prisotnost specifičnih protiteles proti ustreznemu antigenu. Rezultat študije, opravljene z metodo imunskega blotinga, se izda v obliki seznama protiteles proti specifičnim proteinom patogena. Na primer: "protitelesa proti proteinom p17 in p24 so bila identificirana."

Po razvoju lahko nitrocelulozne madeže dolgo časa hranite suhe. Vendar je intenzivnost barve znatno oslabljena. Mokre madeže je mogoče fotografirati ali injicirati s skenerji grafična slika v pomnilnik osebnih računalnikov. Posebni računalniški programi vam omogočajo obdelavo dobljenih rezultatov in hitro spremljanje dinamike spektra protiteles med dinamičnim opazovanjem

Posebnosti:

• Komplet reagentov "MPBA - Blot - HIV-1, HIV-2" vsebuje prečiščen lizat virusnih proteinov HIV 1 in peptid - antigenski determinat gp36 HIV-2;
• Omogoča odkrivanje protiteles proti HIV-1, HIV-1 skupine O, HIV 2 na enem traku;
• Preprost postopek za pripravo in izvedbo analiz;
• Notranji nadzor kakovosti reakcije *
• Največja hitrost analize (3 ure);
• Majhen volumen preskusnega vzorca - 20 μl;
• Ne potrebuje dodatne opreme za raziskave;
• Kakovost kompleta je zagotovljena z uporabo ruskih in mednarodnih referenčnih materialov **

* Notranji nadzor kakovosti zagotavlja prisotnost:

• notranji kontrolni trakovi, zagotavlja nadzor dodajanja vzorca seruma ali plazme;
• kontrolni negativni serum (K-);
• kontrolni pozitivni serum (K +), ki omogoča identifikacijo pasov, odkritih na traku;
• kontrolo šibko pozitivnega seruma (K + cl), ki zagotavlja kontrolo občutljivosti kompleta reagentov.

**Zagotavljanje kakovosti:

Značilnosti nabora reagentov "MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2" so bile določene s testiranjem vzorcev naključnega vzorca darovalcev, bolnikov z diagnozo okužba s HIV, komercialne serokonverzivne plošče, standardne plošče in vzorci s komponentami, ki "potencialno motijo ​​odkrivanje".

Nabor reagentov ne daje lažno pozitivnih rezultatov pri študiji standardnih panelnih serumov, ki ne vsebujejo protiteles proti HIV 1,2 in HIV-1 antigenu ("Standard AT (-) HIV", št. FSR 2007/00953 z dne 25.10. .2007). Specifičnost je 100%.

Diagnostična specifičnost je bila določena s preučevanjem naključnega vzorca 200 darovalcev iz različnih krvnih centrov in klinik s predhodno potrjeno odsotnostjo okužbe s HIV-1, HIV-2. Specifičnost pri študiji naključnega vzorca darovalcev je bila 100 %;

Specifičnost kompleta reagentov smo določili s pregledom 250 vzorcev, vključno z vzorci seruma ali plazme, pridobljenimi pri nosečnicah, hospitaliziranih bolnikih s hepatitisom C in E ter vzorci s "potencialno motečimi" komponentami. Pri uporabi nabora "MPBA-Blot-HIV-1, HIV-2" za te vzorce niso našli lažno pozitivnih rezultatov.

Diagnostična občutljivost je bila določena z:
- vzorci plazme s plošče Boston Biomedica, Inc HIV-1 (WWRB 301) iz različnih regij, ki vsebujejo različne podtipe HIV-1: skupina M (podtipi A, B, C, D, E, F) in skupina O; občutljivost kompleta reagentov je bila 100 %;

Občutljivost kompleta reagentov je bila določena v študiji mednarodnih panelov za serokonverzijo Boston Biomedica, Inc (SeraCare Life Sciences), kat. št. PRB 903, PRB 904, PRB 909, PRB 912, PRB 916, PRB 917, PRB 918, PRB 919, PRB 921, PRB 923, PRB 924, PRB 927, PRB 928, PRB 934.

Komplet reagentov zazna protitelesa proti HIV-1 v serumu standardne plošče, ki vsebuje protitelesa proti HIV-1 ("Standard AT (+) HIV-1", št. FSR 2007/00953 z dne 25. 10. 2007), zazna protitelesa proti HIV -2 v serumih standardne plošče, ki vsebuje protitelesa proti HIV-2 ("Standard AT (+) HIV-2", št. FSR 2007/00953 z dne 25. 10. 2007). Občutljivost - 100%.

Potrdilo o registraciji št. FSR 2010/07958 z dne 13. julija 2011 (veljavnost ni omejena)

Sestava:

• Imunosorbent. Trakovi iz bele nitrocelulozne membrane s posameznimi proteini HIV-1 (gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17), adsorbiranimi na njih z metodo elektrotransfera in nanesenimi na trak s sintetičnim peptidom HIV-2, analog proteina gp36 in anti-človeški IgG (notranja kontrola) - 18 kosov;
• K- - kontrolni negativni serum. Človeški krvni serum, ki ne vsebuje protiteles proti HIV-1,2, HCV, HIV antigenu, HBsAg, se inaktivira s segrevanjem pri 560C; bistra svetlo rumena tekočina - 1 cev (0,08 ml). Vsebuje konzervanse: timerosal in natrijev azid;
• K + - kontrolni pozitivni serum. Človeški krvni serum, ki vsebuje protitelesa proti HIV-1,2 (titer najmanj 1:10000), ne vsebuje HBsAg, HIV antigena, protitelesa proti HCV, inaktiviran s segrevanjem pri 560C; bistra svetlo rumena tekočina - 1 tuba (0,08 ml) Vsebuje konzervanse: timerosal in natrijev azid;
• K + sl - šibko pozitiven kontrolni serum. Človeški krvni serum, ki vsebuje protitelesa proti HIV-1,2 (titer ne več kot 1:200), ne vsebuje HBsAg, HIV antigena, protitelesa proti HCV, inaktiviran s segrevanjem pri 560C; bistra svetlo rumena tekočina - 1 cev (0,08 ml). Vsebuje konzervanse: timerosal in natrijev azid;
• RROKk (x10) - raztopina za redčenje vzorcev in konjugata. Koncentrat - pufer Tris, ki vsebuje predhodno obdelan normalni kozji serum; neprozorna siva tekočina - 1 steklenica (10 ml). Vsebuje konzervans: timerosal;
• PRk (x20) - pralna raztopina. Koncentrat - pufer Tris, ki vsebuje Tween-20; prozorna brezbarvna tekočina - 1 steklenica (70 ml). Vsebuje konzervans: timerosal;
• Konjugirati. kozja protitelesa proti humanemu IgG, konjugirana z alkalno fosfatazo; bistra, brezbarvna tekočina - 1 tuba (0,06 ml);
• Substrat (raztopina za barvanje). Raztopina 5-bromo-4-fluoro-indolil fosfata (BCIP) in nitro modrega tetrazolija (NBT); bistra svetlo rumena tekočina - 1 steklenica (50 ml);
• Imunski blotting prašek. Posneto mleko v prahu - amorfni bel ali svetlo rumen prah - 5 pak. x 1 g;
• Krožnik s pokrovom za nastavitev reakcije - 2 kosa;
• Plastična pinceta - 1 kos.

ELISA v trdni fazi - različica testa, ko se ena od komponent imunskega odziva (antigen ali protitelo) sorbira na trdnem nosilcu, na primer v vdolbinicah polistirenskih plošč. Komponente se identificirajo z dodatkom označenih protiteles ali antigenov. Če je rezultat pozitiven, se barva kromogena spremeni. Vsakič po dodajanju naslednje komponente se nevezani reagenti odstranijo iz vdolbinic s pranjem,

Pri določanju protiteles (leva slika) se v vdolbinice plošč s sorbiranim antigenom zaporedno dodajo bolnikov krvni serum, antiglobulinski serum, označen z encimom, in substrat/kromogen za encim.

II. Pri določanju antigena (desna slika) se antigen vnese v vdolbinice z adsorbiranimi protitelesi (na primer krvni serum z želenim antigenom), diagnostičnim serumom proti njemu in sekundarnimi protitelesi (proti diagnostičnemu serumu), označenimi z dodamo encim in nato substrat/kromogen za encim.

Konkurenčni ELISA za določanje antigenov: ciljni antigen in z encimom označeni antigen tekmujeta med seboj za vezavo omejenega števila protiteles imunskega seruma.

Drug test je kompetitivni ELISA za določanje protiteles: ciljna protitelesa in z encimom označena protitelesa tekmujejo med seboj za antigene, adsorbirane na trdni fazi.

Imunobloting- zelo občutljiva metoda za odkrivanje beljakovin, ki temelji na kombinaciji elektroforeze in ELISA ali RIA. Imunobloting se uporablja kot diagnostična metoda za okužbo s HIV itd.

Antigene patogena ločimo z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu, nato prenesemo iz gela v aktiviran papir ali nitrocelulozno membrano in razvijemo z ELISA. Podjetja proizvajajo takšne trakove z antigenom. Na te trakove se nanese pacientov serum. . Nato po inkubaciji nevezana protitelesa bolnika speremo in nanesemo serum proti humanim imunoglobulinom, označenim z encimom. . Kompleks [antigen + pacientovo protitelo + protitelo proti humanemu Ig], ki nastane na traku, odkrijemo z dodajanjem kromogenega substrata, ki spremeni barvo pod delovanjem encima.

52. Interferoni, narava. Metode pridobivanja in uporabe.

Interferon spada med pomembne zaščitne beljakovine imunskega sistema. Odkrili so ga pri študiji interference virusov, to je pojava, ko živali ali celične kulture, okužene z enim virusom, postanejo neobčutljive na okužbo z drugim virusom. Izkazalo se je, da je motnja posledica nastalega proteina, ki ima zaščitno protivirusno lastnost. Ta protein se je imenoval interferon.

Interferon je družina glikoproteinskih beljakovin, ki jih sintetizirajo celice imunskega sistema in vezivnega tkiva. Glede na to, v katerih celicah se sintetizira interferon, ločimo tri vrste: α, β in γ-interferone.

Alfa interferon proizvajajo levkociti in se imenuje levkocit; beta interferon imenujemo fibroblastni, saj ga sintetizirajo fibroblasti - celice vezivnega tkiva, in gama interferon- imunski, saj ga proizvajajo aktivirani T-limfociti, makrofagi, naravne celice ubijalke, torej imunske celice.

Interferon se v telesu nenehno sintetizira, njegova koncentracija v krvi pa se ohranja na približno 2 ie / ml (1 mednarodna enota - ME je količina interferona, ki ščiti celično kulturo pred 1 virusom CPE 50). Proizvodnja interferona se močno poveča, ko je okužena z virusi, pa tudi, ko je izpostavljena induktorjem interferona, na primer RNA, DNK, kompleksnim polimerom. Takšni induktorji interferona se imenujejo interferonogeni.

Poleg protivirusnega učinka ima interferon protitumorsko zaščito, saj zavira proliferacijo (množenje) tumorskih celic, pa tudi imunomodulatorno aktivnost, spodbuja fagocitozo, naravne celice ubijalke, uravnava proizvodnjo protiteles s celicami B, aktivira izražanje glavnih kompleks histokompatibilnosti.

Mehanizem delovanja interferon je kompleksen. Interferon ne vpliva neposredno na virus zunaj celice, ampak se veže na posebne receptorje celic in vpliva na proces razmnoževanja virusa znotraj celice v fazi sinteze beljakovin.

Uporaba interferona... Delovanje interferona je učinkovitejše, prej se začne sintetizirati ali vstopi v telo od zunaj. Zato se uporablja v preventivne namene za številne virusne okužbe, kot je gripa, pa tudi za terapevtski namen pri kroničnih virusnih okužbah, kot so parenteralni hepatitis (B, C, D), herpes, multipla skleroza itd. Interferon daje pozitivne rezultate pri zdravljenju malignih tumorjev in bolezni, povezanih z imunsko pomanjkljivostjo.

Interferoni so specifični za vrsto, to pomeni, da je človeški interferon manj učinkovit za živali in obratno. Vendar je ta specifičnost za vrsto relativna.

Pridobivanje interferona... Interferon se pridobiva na dva načina: a) z okužbo človeških levkocitov ali limfocitov z varnim virusom, zaradi česar okužene celice sintetizira interferon, ki se nato izolira in iz njega oblikuje pripravke interferona; b) gensko spremenjeni – z gojenjem v industrijskih pogojih rekombinantnih sevov bakterij, ki lahko proizvajajo interferon. Običajno uporabljajo rekombinantne seve pseudomonas, Escherichia coli z interferonskimi geni, ki so vgrajeni v njihovo DNK. Gensko spremenjeni interferon se imenuje rekombinantni. V naši državi je rekombinantni interferon dobil uradno ime "Reaferon". Proizvodnja tega zdravila je v mnogih pogledih učinkovitejša in cenejša od levkocitne.

Rekombinantni interferon je našel široko uporabo v medicini kot profilaktično in terapevtsko sredstvo za virusne okužbe, neoplazme in imunske pomanjkljivosti.

Opis

Metoda določanja Imunoblot.

Študijsko gradivo Krvni serum

Možnost obiska na domu

Antinukleinska protitelesa so družina avtoprotiteles, ki se vežejo na ribonukleinske kisline in z njimi povezane beljakovine. Pojavijo se pri več kot 90 % bolnikov z difuznimi boleznimi vezivnega tkiva, pogosto pa jih opazimo tudi pri avtoimunskih boleznih jeter in številnih drugih stanjih. Do danes je bilo opisanih okoli 200 vrst te družine avtoprotiteles, vendar jih vseh ni mogoče uporabiti v klinični praksi.

Imunoblot antinuklearnih protiteles omogoča v enem testu hkratno preučevanje 15 glavnih vrst protinuklearnih protiteles, kar zagotavlja diferencialna diagnoza glavne sistemske revmatične bolezni. Vsako vrsto avtoprotiteles, ki jih odkrije imunoblot, običajno opazimo pri bolnikih z značilno klinično sliko, zato spekter avtoprotiteles omogoča ne le diagnosticiranje bolezni, temveč tudi ugotavljanje tveganja za razvoj določenih kliničnih manifestacij.

Imunoblot antinuklearnih protiteles je priporočljivo uporabiti v drugi fazi serološke preiskave, ko pozitiven rezultat druge preiskave, ki kažejo na prisotnost antinuklearnih protiteles v serumu pregledane osebe. Ti testi vključujejo določanje antinuklearnih protiteles (ELISA presejanje), odkrivanje antinuklearnega faktorja (ANF) na celicah Hep2 (), antinuklearnih protiteles in protiteles proti jedrskemu antigenu, ki ga je mogoče ekstrahirati (ENA,).

Za metodo imunoblotinga protinuklearnih protiteles pri diagnostiki sistemskih revmatskih bolezni je značilna visoka klinična specifičnost. Toda specifičnosti antinuklearnih protiteles, tudi pri visokih titrih ANP (), ni vedno mogoče ugotoviti, saj številni antigeni protinuklearnih protiteles še vedno niso značilni. Negativen rezultat imunoblota v tem primeru ne izključuje diagnoze sistemskih revmatskih bolezni. Številna antinuklearna protitelesa je mogoče odkriti z uporabo imunoblota - plošče avtoprotiteles, specifičnih za miozitis () in imunoblota - plošče avtoprotiteles pri sklerodermi ().

Literatura

1. Lapin S.V. Totolyan A.A. Imunološka laboratorijska diagnostika avtoimunskih bolezni / Založba "Chelovek", Sankt Peterburg - 2010. 272 ​​str.
2. E. L. Nasonov, E. N. Aleksandrova Sodobni standardi za laboratorijsko diagnostiko revmatičnih bolezni. Klinične smernice/ BHM, M - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Avtoprotitelesa pri organsko specifičnih avtoimunskih boleznih: Diagnostična referenca / PABST, Dresden - 2011.300 str.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Avtoprotitelesa pri sistemskih avtoimunskih boleznih: Diagnostična referenca / PABST, Dresden - 2007.300 str.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Avtoprotitelesa 2. izd./ Elsevier Science - 2006.862 str.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Diagnostična merila pri avtoimunskih boleznih / Humana Press - 2008.598 str.
7. Navodila za komplet reagentov.

Priprava

Zaželeno je vzdržati 4 ure po zadnjem obroku, ni obveznih zahtev.

Indikacije za imenovanje

Test je indiciran za diagnozo in diferencialno diagnozo naslednjih stanj:

• sistemski eritematozni lupus;
• subakutni kožni lupus in druge vrste kožnega lupusa;
• mešana bolezen vezivnega tkiva;
• Sjogrenov sindrom in pridružene bolezni;
• difuzna in lokalizirana skleroderma, CREST sindrom;
• vnetne miopatije (polimiozitis in dermatomiozitis);
• juvenilni kronični artritis;
• avtoimunski hepatitis;
• primarna biliarna ciroza in sklerozirajoči holangitis;
• uporaba tega testa je indicirana, kadar se odkrijejo visoki titri antinuklearnega faktorja, antinuklearnih protiteles, protiteles proti jedrskemu antigenu, ki ga je mogoče ekstrahirati, protiteles proti DNK, protitelesom proti nukleosomom in antifosfolipidnim protitelesom.

Interpretacija rezultatov

Interpretacija rezultatov testov vsebuje informacije za lečečega zdravnika in ne predstavlja diagnoze. Informacij v tem razdelku ni mogoče uporabiti za samodiagnozo in samozdravljenje. Natančno diagnozo postavi zdravnik z uporabo rezultatov tega pregleda in potrebnih informacij iz drugih virov: anamneze, rezultatov drugih preiskav itd.

Merske enote: kvalitativni test, rezultat je predstavljen v obliki "najdeno" ali "ni najdeno".

Ko najdemo pas, ki označuje prisotnost določene vrste protiteles, se intenzivnost barve traku dodatno opiše s številom plusov ("križi") za vsako od identificiranih vrst protiteles. Povečanje stopnje pozitivnosti posredno odraža vsebnost in afiniteto avtoprotiteles.

Referenčne vrednosti: protitelesa proti Sm, RNP / Sm, SS-A (60 kDa), SS-A (52 kDa), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENP-B, dsDNA, histon, nukleosom , rebra P, AMA-M2, Jo-1 ni bilo mogoče najti.

Rezultat določanja avtoprotiteles je predstavljen v križcih za vsak ustrezen antigen. Povečanje stopnje seropozitivnosti posredno odraža vsebnost in afiniteto avtoprotiteles. Različice rezultata ocene seropozitivnosti so navedene spodaj:

1. Protitelesa niso bila odkrita.
2. +/- - mejni rezultat;
3. + - nizka vsebnost avtoprotiteles proti specifičnemu antigenu;
4. ++ - povprečna vsebnost avtoprotiteles proti določenemu antigenu;
5. +++ - visoka vsebnost avtoprotiteles proti specifičnemu antigenu.

Glavne bolezni, povezane z odkrivanjem antinuklearnih protiteles:

Imunski bloting(Western Blot, Western Blot)- združuje encimsko vezan imunski test (ELISA) s predhodnim elektroforetskim prenosom virusnih antigenov na nitrocelulozni trak (trak).

V tem lepem znanstvenem imenu je "blot" najverjetneje preveden kot "blot" in "western" - kot "zahodni" odraža smer širjenja te "blot" na papirju od leve proti desni, torej na geografskem zemljevid ustreza smeri od zahoda proti vzhodu." Bistvo metode "imune blot" je, da se encimsko povezana imunosorbentna reakcija ne izvaja z mešanico antigenov, ampak z antigeni HIV, ki so bili predhodno razporejeni z imunoforezo v frakcije, ki se nahajajo glede na molekulsko maso na površini nitroceluloze. membrano. Posledično so glavni proteini HIV, nosilci antigenskih determinant, razporejeni po površini v obliki ločenih pasov, ki se kažejo med encimsko imunosorbentno reakcijo.

Imunoblot vključuje več stopenj:

Priprava traku. Virus imunske pomanjkljivosti (HIV), ki je bil predhodno očiščen in uničen do svojih sestavnih delov, je podvržen elektroforezi, medtem ko so antigeni, ki so del HIV, ločeni po molekulski masi. Nato se z blotiranjem (analogno iztiskanju odvečnega črnila na blotterju) antigeni prenesejo na trak nitroceluloze, ki zdaj vsebuje spekter antigenskih pasov, ki je očesu neviden, značilen za HIV.

Vzorčna raziskava. Testni material (serum, krvna plazma bolnika itd.) se nanese na nitrocelulozni trak in če vzorec vsebuje specifična protitelesa, se vežejo na strogo ustrezne (komplementarne) antigenske trakove. Kot rezultat kasnejših manipulacij se rezultat te interakcije vizualizira - postane viden.

Interpretacija rezultata. Prisotnost trakov na določenih območjih nitrocelulozne plošče potrjuje prisotnost protiteles proti strogo določenim antigenom HIV v preučevanem serumu.

Pas A - Pozitivna kontrola

Vrstica B - Šibka pozitivna kontrola

Pas C - Negativna kontrola

Steza D - pozitiven vzorec (odkrita protitelesa proti HIV-1)

Trenutno je imunski bloting (imunoblot) glavna metoda za potrditev prisotnosti virusno specifičnih protiteles v preučevanem serumu. V nekaterih primerih okužbe s HIV, pred razvojem serokonverzije, se specifična protitelesa učinkoviteje odkrijejo z imunskim blotiranjem kot ELISA. V študiji z metodo imunskega blotinga je bilo ugotovljeno, da se protitelesa proti gp 41 najpogosteje odkrijejo v serumih bolnikov z aidsom, odkrivanje p24 pri osebah, ki so pregledane v profilaktične namene, pa zahteva dodatne študije o prisotnosti okužbe s HIV. Ugotovljeno je bilo, da so testni sistemi za imunsko blotiranje, ki temeljijo na gensko spremenjenih rekombinantnih proteinih, bolj specifični od običajnih sistemov, ki temeljijo na prečiščenem virusnem lizatu. Pri uporabi rekombinantnega antigena ne nastane razpršen, ampak jasno izražen ozek pas antigena, ki je lahko dostopen za snemanje in oceno.

Serumi oseb, okuženih s HIV-1, kažejo protitelesa proti naslednjim osnovnim proteinom in glikoproteinom - proteini strukturne ovojnice (env) - gp160, gp120, gp41; jedra (gag) - p17, p24, p55, pa tudi virusni encimi (pol) - p31, p51, p66. Za HIV-2 so značilna protitelesa proti env - gp140, gp105, gp36; gag - p16, p25, p56; pol - str.68.

Med laboratorijske metode, ki je potreben za ugotavljanje specifičnosti reakcije, je najbolj prepoznavno odkrivanje protiteles proti proteinom ovojnice HIV-1 - gp41, gp120, gp160 in HIV-2 - gp36, gp105, gp140.

WHO šteje za pozitivne serume, v katerih se z metodo imunskega blotinga odkrijejo protitelesa proti katerima koli dva glikoproteina HIV. V skladu s temi priporočili, če pride do reakcije samo z enim od beljakovin ovojnice (gp 160, gp 120, gp 41) v kombinaciji ali brez reakcije z drugimi beljakovinami, se rezultat šteje za dvomljiv in je priporočljivo, da se ponovno testira z uporabo komplet druge serije ali drugega podjetja. Če tudi po tem rezultat ostane dvomljiv, je priporočljivo opazovanje 6 mesecev (študije po 3 mesecih).

Prisotnost pozitivne reakcije z antigenom p24 lahko kaže na obdobje serokonverzije, saj se protitelesa proti tej beljakovini včasih pojavijo najprej. V tem primeru je glede na klinične in epidemiološke podatke priporočljivo ponoviti študijo z vzorcem seruma, odvzetim vsaj 2 tedna pozneje, kar je ravno v primeru, ko so za okužbo s HIV potrebni parni serumi.

Pozitivne reakcije z gag in pol proteini brez reakcije z beljakovinami env lahko odražajo zgodnjo stopnjo serokonverzije in lahko kažejo tudi na okužbo s HIV-2 ali nespecifično reakcijo. Posameznike s takšnimi rezultati po testiranju na HIV-2 ponovno pregledamo po 3 mesecih (v 6 mesecih).