Obstaja veliko metod za kvalitativno in kvantitativno določanje virusno specifičnih protiteles. S temi metodami je mogoče istočasno odkriti tako IgM kot IgG ter ločeno imunoglobuline vsakega razreda. Praviloma se v reakciji vezave komplementa odkrijejo le virusi specifični IgG. Vendar pa je pri preskušanju mikrobioloških antigenov s to metodo mogoče istočasno določiti specifične IgM in IgG.

Imunološke metode se uporabljajo predvsem za dva namena: prvič, za diagnosticiranje trenutne, dokončane ali prirojene virusne okužbe in, drugič, za odkrivanje specifičnih protiteles, katerih prisotnost kaže na preteklo okužbo in s tem na odpornost na morebitno ponovno okužbo. Glede na moč imunskega odziva na virusno okužbo se ljudje med seboj zelo razlikujejo. Na sl. 3 prikazuje tipično krivuljo dviga titra

protitelesa kot odziv na primarno okužbo z rdečkami. Preprosto je ugotoviti, da je diagnoza rdečk možna s povečanjem titra specifičnega IgG in identifikacijo specifičnega IgM. Prisotnost specifičnega IgM v krvi novorojenčka kaže na intrauterino okužbo, saj materinski IgM, za razliko od IgG, zadrži posteljica. Specifični IgG iz primarne okužbe običajno traja vse življenje. Zato prisotnost protiteles tega razreda v krvnem serumu kaže na odpornost na ustrezno ponovno okužbo.

Spodaj so imunološke metode za odkrivanje specifičnih protiteles proti virusu rdečk, ki so še posebej učinkovite pri diagnosticiranju bolezni ploda in določanju titra specifičnih protiteles v krvnem serumu. Podrobni opisi metode za diagnosticiranje rdečk najdete v pregledih Pattisona in Morgan-Kapnerja.

Reakcija zaviranja hemaglutinacije

Virus rdečk pri mnogih živalskih vrstah povzroča hemaglutinacijo rdečih krvnih celic. Najpogosteje se v RTGA uporabljajo eritrociti enodnevnih piščancev. V tej reakciji virus, gojen v kulturi in zdravljen s Twenom 80 in etrom, služi kot hemaglutinirni antigen virusa rdečk. Predhodno zdravljenje poveča titer HA virusa.

5.1.1 Standardizacija antigena HA virusa rdečk

1. 1 ml 50% suspenzije piščančjih eritrocitov trikrat speremo v pufru Veronal z dekstranom in želatino s centrifugiranjem in resuspenziranjem peletov v 15-mililitrski merilni epruveti. Oprane celice ponovno suspendiramo v pufru DGV, da dobimo 30% suspenzijo.

Tabela 3. Priprava veronalnega pufra z dekstranom in želatino

2. Liofilizirani pripravek HA-antigena virusa rdečk razredčite v količini destilirane vode, ki je potrebna v skladu z navodili.

3. Dodajte 1 volumen DGV v vsako od osmih vdolbinic dveh sosednjih vrst mikrotitarske plošče s polistirenom s 96 vdolbinicami z različnimi vdolbinicami U.

4. V prve vdolbinice dveh vrstic dodamo en volumen antigena HA virusa rdečk.

5. Serijske dvojne razredčitve antigena rdečk HA, v razponu od 1: 2 do 1: 256, pripravimo z 0,025 ml mikrotiterjem. Pred uporabo je treba glavo mikro titratorja žgati v vročem ognju, nato nekaj sekund ohladiti, dati v destilirano vodo in obrisati s filtrirnim papirjem.

6. V vsako od napolnjenih vdolbinic dodamo še en volumen pufra DGV. Kot kontrolo se v vdolbinice 12 prvih dveh vrstic dodata dva volumna pufra DGV.

7. Suspenzijo opranih eritrocitov piščancev 100-krat razredčimo z DGV-pufrom in tako dobimo 0,03% suspenzijo.

8. V vseh 18 vdolbinic dodamo dva volumna 0,03% suspenzije eritrocitov, končno ploščo pokrijemo z drugo neuporabljeno ploščo in inkubiramo 1 uro pri 4 ° C.

9. Na dnu kontrolnih jam se tvori gosta "plošča" neaglutiniranih eritrocitov. Aglutinirani eritrociti se enakomerno usedejo. Titar HA velja za recipročno največjo redčenje HA-antigena virusa rdečk, pri katerem še vedno pride do popolne aglutinacije. Ta razredčitev vsebuje 1 enoto hemaglutiniranja.

Za testiranje serumov uporabimo 4 enote GA antigena rdečk. Če je torej titer antigena GA 32, ga osemkrat razredčimo z DGV za odkrivanje protiteles proti virusu rdečk. Razredčeni antigen je stabilen 25-48 ur pri 4 ° C.

5.1.2 Predpriprava sirotke

Vsi serumi vsebujejo nespecifične zaviralce hemaglutinacije, ki jih je treba odstraniti. Nespecifični zaviralci GA so predvsem lipoproteini, ki se sproščajo iz seruma z obdelavo seruma s kaolinom. Poleg tega so v človeških serumih lahko prisotni nespecifični aglutinini piščančjih eritrocitov. Vendar predhodna adsorpcija testiranih serumov z eritrociti ni potrebna, saj vse nespecifične hemaglutinine, prisotne v serumih, najdemo v kontrolah.

1. V steklene epruvete s številkami dodajte 0,2 ml seruma. Poleg preučenih serumov so v vsakem poskusu potrebne pozitivne in negativne kontrole.

2. V vsako epruveto dodajte 0,8 ml 25% kaolina v puferu boratne soli.

3. Vsebino epruvete pretresite in pustite pri sobni temperaturi 20 minut.

4. Odrabljeni kaolin oborimo s centrifugiranjem v namizni centrifugi pri 2000 vrt / min 20 minut.

5. Prenesite supernatant v čiste, oštevilčene epruvete. Kot rezultat čiščenja dobimo serum, razredčen štirikrat. Uporabljajo se za pripravo reakcije zaviranja hemaglutinacije. Sera lahko shranite pri 4 ° C čez noč.

5.1.3 Reakcijska inhibicija hemaglutinacije

1. Za testiranje enega vzorca seruma dodajte eno količino DGV v eno vrsto vdolbinic.

2. V prvo in zadnjo vdolbinico dodajte en volumen štirikrat razredčenega seruma.

3. Z mikrotiterjem pripravite zaporedne dvojne razredčitve seruma.

4. En volumen GA-antigena rdečk, ki vsebuje 4 GAU, dodamo v jamice 1-10. Antigen Rubella GA ni dodan v jamico 12.

5. V vdolbinice 1-8 druge plošče dodamo en volumen delovne razredčitve antigena rdečk HA, nato pa v osmih vdolbinicah pripravimo zaporedne dvojne razredčitve antigena HA. V teh 16 vrtin se doda en volumen DGV. Ta titracija je test za antigen rdečk HA. Za kontrolo se v vdolbinice 12 prve in druge vrstice dodata dva volumna DGV.

6. Pokrite plošče pustimo 1 uro pri sobni temperaturi ali čez noč pri 4 ° C.

7. V vse napolnjene vdolbinice dodamo dva volumna 0,03% suspenzije piščančjih eritrocitov in plošče pustimo 1 - 1,5 ure pri 4 ° C.

8. S pregledovanjem plošč določite titer antigena rdečk HA. V kontrolnih vrtinah ne sme priti do aglutinacije.

9. Če so v serumu aglutinirani eritrociti v odsotnosti antigena rdečk GA, je treba ponovno testirati začetno razredčitev seruma. Pred tem serum adsorbira z eno kapljico 30% suspenzije piščančjih eritrocitov 1 uro pri sobni temperaturi, nato pa eritrocite oborimo s centrifugiranjem.

10. Titer specifičnih protiteles v preučenem serumu se šteje za recipročno vrednost razredčitve, pri kateri je hemaglutinacija popolnoma potlačena.

5.1.4 Razlaga rezultatov

Pri nizkem titru je rezultate težko razlagati, saj je pri majhni razredčitvi možna preostala prisotnost nespecifičnih zaviralcev. Šteje se, da je prisotnost virusno specifičnih protiteles dokazana pri titru 16 ali več.

Reakcija zaviranja hemaglutinacije (RTGA) je metoda za identifikacijo virusa ali odkrivanje protivirusnih protiteles v krvnem serumu pacienta, ki temelji na pojavu odsotnosti aglutinacije eritrocitov z zdravilom, ki vsebuje virus, v prisotnosti seruma, imunskega nanj.

Mnogi virusi lahko aglutinirajo eritrocite strogo določenih vrst sesalcev in ptic. Torej virusi gripe in mumpsa aglutinirajo eritrocite piščancev, morski prašički, človeški in adenovirusi - eritrociti podgan, miši. V zvezi s tem se za njihovo odkrivanje v materialu bolnikov ali v kulturah celic, zarodkov in živali določi reakcija hemaglutinacije (RHA). Za to se v vdolbinicah plošč pripravijo dvakrat naraščajoče razredčitve cepljenih materialov in tekočin, ki jim dodamo suspenzije eritrocitov NaCl, oprane z izotonično raztopino. Za nadzor spontane aglutinacije se eritrociti pomešajo z enakim volumnom izotonične raztopine NaCl. Mešanice inkubiramo v termostatu pri 37 ° C ali pri sobni temperaturi.

Rezultati RGA se upoštevajo po naravi aglutinacije eritrocitov po 30-60 minutah, ko se običajno pri kontroli popolnoma oborijo. Pozitivne reakcije so označene z plusi. "++++" - usedlina v obliki "dežnika", "+++" - sediment z vrzeli, "++" - sediment z velikimi vrzeli, "+" - flokulentni sediment, obdan s cono zmečkanih eritrocitov , in " -" - enako ostro začrtana usedlina eritrocitov v obliki "gumba", kot pri nadzoru.

Ker je RHA specifična za skupino, ne omogoča določitve vrste virusov. Prepoznamo jih z reakcijo inhibicije hemaglutinacije (HAI). Za njegovo nastavitev se uporabljajo znani imunski protivirusni serumi, ki jih razredčimo v izotonični raztopini natrijevega klorida v dvakrat nižjih koncentracijah in vlijemo v vdolbinice. Vsaki njihovi razredčitvi se doda enaka količina cepljene tekočine. Kontrola je suspenzija virusa v izotonični raztopini natrijevega klorida. Plošče z mešanico serumov in virusov hranimo v termostatu 30 minut ali pri sobni temperaturi 2 uri, nato vsakemu dodamo suspenzijo eritrocitov. Po 30 minutah se določi titer nevtralizirajočega seruma (to je njegova največja razredčitev), ki je povzročil zamudo pri aglutinaciji eritrocitov.

RTGA se uporablja pri serološki diagnostiki virusnih bolezni, zlasti gripe in adenovirusnih okužb. Bolje ga je postaviti na enak način kot PH, s seznanjenimi serumi. Štirikratno povečanje titra protiteles v drugem serumu potrjuje domnevno diagnozo.

Reakcija zaviranja hemaglutinacije (RTGA) temelji na blokadi, zatiranju virusnih antigenov s protitelesi imunskega seruma, zaradi česar virusi izgubijo sposobnost aglutiniranja eritrocitov.

RTGA se uporablja za diagnosticiranje številnih virusnih bolezni, katerih povzročitelji (gripa, ošpice, rdečke, virusi klopnega encefalitisa itd.) Lahko aglutinirajo eritrocite različnih živali.

Mehanizem. Tipizacija virusa se izvede v reakciji inhibicije hemaglutinacije (RTGA) z nizom tip-specifičnih serumov. Rezultati reakcije se upoštevajo zaradi odsotnosti hemaglutinacije. Podtipe virusa A z antigeni H 0 N 1, H 1 N 1, H 2 N 2, H 3 N 2 itd. Je mogoče v RTGA razlikovati z nizom homolognih za tip specifičnih serumov.

V zadnjem času se reakcija pogosto uporablja v kliničnih viroloških laboratorijih za določanje titrov specifičnih protiteles proti nekaterim virusom, pa tudi za serološko identifikacijo in tipizacijo izolatov virusa iz kliničnega materiala bolnikov. Uporabljajo se nekoliko omejeno zaradi prisotnosti v krvnem serumu ljudi nespecifičnih zaviralcev virusov, pa tudi naravnih protiteles - aglutininov.

Načelo RTGA sestoji iz mešanja enakih količin krvnega seruma in suspenzije virusa v epruveti, po izpostavitvi pa se ugotovi, ali se virus v mešanici ohrani z dodajanjem suspenzije eritrocitov. Aglutinacija eritrocitov kaže na prisotnost, odsotnost hemaglutinacije pa na odsotnost virusa v mešanici. Izginotje virusa iz mešanice virus + serum se obravnava kot znak interakcije serumskih protiteles in virusa.

Toda protitelesa medsebojno delujejo z antigeni v strogo določenih količinskih razmerjih. Zato je za določeno količino virusa odvzeta sposobnost hemaglutiniranja potreben določen minimum protiteles, in ker je ena od komponent RTGA vedno neznana, je treba reakcijo postaviti v vrsto preskusov epruvete z različnimi odmerki protiteles in enakimi odmerki virusa ali obratno. To dosežemo z uporabo različnih razredčitev seruma in iste razredčitve virusa ali različnih razredčitev virusa in iste razredčitve seruma.

RTGA omogoča reševanje naslednjih nalog: določiti titer protiteles proti virusu hemaglutiniranja v serumu; identificirati neznani virus hemaglutiniranja po znanih serumih; za določitev stopnje antigenskega odnosa dveh virusov.

Prednosti RTGA: preprostost tehnologije, hitrost, sterilno delo ni potrebno, specifičnost, nizki stroški. Pomanjkljivost: RTGA je možna le pri hemaglutinirajočih virusih.

Načelo titracije protiteles v RTGA kot sledi:

- pripravite vrsto zaporednih (običajno 2-kratnih) razredčitev preskusnega seruma v enakih količinah (običajno 0,25 ali 0,2 ml);

- vsaki razredčitvi dodamo enake količine homolognega virusa v titru 4 HAU;

- mešanice se hranijo določen čas pri določeni temperaturi (pri virusu atipične kokošje kuge 40-60 minut pri sobni temperaturi);

- vsem mešanicam se dodajo enake količine 1% suspenzije opranih eritrocitov;

- po izpostavljenosti ocenite hemaglutinacijo v vsaki mešanici pri križancih.

Reakcija vključuje kontrole seruma, virusa in eritrocitov.

Najvišja razredčitev seruma, ki še vedno popolnoma zavira hemaglutinacijo, se upošteva kot pokazatelj titra protiteles v tem serumu.

Uporaba hemadsorpcijskih reakcij v virologiji.

RGAD. Hemadsorpcijo - povezavo eritrocitov s površino celic, ki jih virus prizadene - sta prvič odkrila Vogel in Shchelokov (1957) na tkivni kulturi, okuženi z virusom gripe. Ta pojav temelji na odnosu virusnih receptorjev, ki se nahajajo na površini prizadete celice, z receptorji za eritrocite, kar vodi do njihove medsebojne adhezije, podobne reakciji hemaglutinacije. Prednost te reakcije je, da postane pozitivna že pred pojavom izrazitih citopatskih sprememb v okuženih celicah.

RGAD metodologija kot sledi. 3-4 dan po okužbi celic vzemite dve epruveti z isto kulturo celic, od katerih je ena okužena s cepljenim materialom, druga pa kontrolna. Tekočino iz kulture odcedimo iz obeh epruvet in v obe dodamo 2-3 kapljice 0,5% suspenzije opranih eritrocitov. Obe epruveti pustimo 5-10 minut, tako da so eritrociti na površini celic (postavljeni vodoravno na mizo), nato pa jih rahlo speremo s fiziološko raztopino in pregledamo pod mikroskopom (majhna povečava). V kontrolni cevi se eritrociti popolnoma odstranijo s fiziološko raztopino, nekateri preostali pa plavajo s tekočino. Če se v okuženi epruveti eritrociti ne odstranijo s fiziološko raztopino in ne plavajo, ampak so pritrjeni na površino celic, je treba šteti, da je RHAD pozitiven.

Odvisno od virusa in vrste celic je lahko lokacija rdečih krvnih celic trojna:

- eritrociti se adsorbirajo le ob obodu celične plasti v obliki "ogrlice" (virus afriške prašičje kuge);

- eritrociti se nahajajo na celični plasti v žariščih ali grozdih (virus gripe);

- eritrociti se difuzno nahajajo na celični plasti (virus parainfluence).

Vsak virus lahko adsorbira rdeče krvne celice nekaterih vrst živali.

Serološka diagnoza virusnih bolezni, ki temelji na povečanju titra protiteles v parnih krvnih serumih.

Reakcija hemaglutinacije (RHA) in reakcija zaviranja hemaglutinacije (RTGA), mehanizem, komponente in uporaba reakcij.

Reakcija hemaglutinacije temelji na pojavu adhezije eritrocitov, ki nastane pod vplivom različnih dejavnikov. Razlikovati med neposredno in posredno hemaglutinacijo.

Eritrocite najprej speremo z izotonično raztopino natrijevega klorida, nato jih po potrebi (pri uporabi antigenov beljakovinske narave) obdelamo z raztopino tanina 1: 20.000 in senzibiliziramo s topnimi antigeni. Po spiranju z pufrirano izotonično raztopino natrijevega klorida je eritrocitni antigen pripravljen za uporabo.

Študirane serume razredčimo z izotonično raztopino natrijevega klorida v epruvetah ali posebnih plastičnih ploščah z vdolbinicami, nato pa vsaki razredčitvi seruma dodamo eritrocitni diagnostik. Rezultati posredne reakcije hemaglutinacije se upoštevajo glede na naravo usedline eritrocitov, ki nastane na dnu epruvete. Rezultat reakcije velja za pozitiven, pri katerem eritrociti enakomerno pokrijejo celotno dno epruvete. V primeru negativne reakcije se eritrociti v obliki majhnega diska ali "gumba" nahajajo na sredini dna epruvete

Glavni sestavni deli RP:

A) topni antigen,

B) specifična protitelesa (serum)

(RTGA) je metoda za identifikacijo virusa ali odkrivanje protivirusnih protiteles v krvnem serumu pacienta, ki temelji na pojavu odsotnosti aglutinacije eritrocitov s pripravkom, ki vsebuje virus v prisotnosti seruma, imunskega nanj.
temelji na blokadi, zatiranju antigenov virusov s protitelesi imunskega seruma, zaradi česar virusi izgubijo sposobnost aglutiniranja eritrocitov.

RTGA se uporablja za diagnosticiranje številnih virusnih bolezni, katerih povzročitelji (gripa, ošpice, rdečke, virusi klopnega encefalitisa itd.) Lahko aglutinirajo eritrocite različnih živali.
Mehanizem. Tipizacija virusa se izvede v reakciji inhibicije hemaglutinacije (RTGA) z nizom tip-specifičnih serumov. Rezultati reakcije se upoštevajo zaradi odsotnosti hemaglutinacije. Podtipi virusa A z antigeni H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 itd.

lahko razlikujemo v RTGA z nizom homolognih za tip specifičnih serumov.

V središču hemaglutinacijske reakcije leži pojav adhezije eritrocitov, ki nastane pod vplivom različnih dejavnikov.

Razlikovati med neposredno in posredno hemaglutinacijo.
V reakciji neposredne hemaglutinacije se eritrociti zlepijo, ko se nanje adsorbirajo določeni antigeni, na primer virusi.
V seroloških študijah se uporablja reakcija neposredne inhibicije hemaglutinacije, ko virus, izoliran od bolnika, nevtraliziramo s specifičnim imunskim serumom in ga nato združimo z eritrociti.

Odsotnost hemaglutinacije kaže na skladnost virusa in uporabljenega imunskega seruma.

Reakcijo posredne hemaglutinacije (pasivna hemaglutinacija) opazimo, ko imunski serum ali pacientov serum z ustreznimi protitelesi dodamo eritrocitom, predhodno zdravljenim (senzibiliziranim) z različnimi antigeni.

Obstaja specifično lepljenje eritrocitov, njihova pasivna hemaglutinacija.

Reakcija posredne ali pasivne hemaglutinacije po občutljivosti in specifičnosti je boljša od drugih seroloških metod in se uporablja pri diagnosticiranju okužb, ki jih povzročajo bakterije, rikecije, praživali.

Tehnika uprizarjanja reakcije posredne hemaglutinacije je sestavljena iz več stopenj.

Eritrocite najprej speremo z izotonično raztopino natrijevega klorida, nato jih po potrebi (pri uporabi antigenov beljakovinske narave) obdelamo z raztopino tanina 1: 20.000 in senzibiliziramo s topnimi antigeni.

Po spiranju z pufrirano izotonično raztopino natrijevega klorida je eritrocitni antigen pripravljen za uporabo. Študirane serume razredčimo z izotonično raztopino natrijevega klorida v epruvetah ali posebnih plastičnih ploščah z vdolbinicami, nato pa vsaki razredčitvi seruma dodamo eritrocitni diagnostik.

Rezultati posredne reakcije hemaglutinacije se upoštevajo glede na naravo usedline eritrocitov, ki nastane na dnu epruvete. Rezultat reakcije velja za pozitiven, pri katerem eritrociti enakomerno pokrijejo celotno dno epruvete. Če je reakcija negativna, se rdeče krvne celice v obliki majhnega diska ali "gumba" nahajajo na sredini dna epruvete.

Reakcija zaviranja hemaglutinacije- serološka reakcija, ki temelji na sposobnosti protiteles, da preprečijo aglutinacijo eritrocitov s hemaglutinirajočimi virusi (adenovirusi, arbovirusi, nekateri enterovirusi, virusi gripe in parainfluence, ošpice, reovirusi).

Specifična protivirusna protitelesa medsebojno delujejo s površinskimi molekulami hemaglutinina virionov teh virusov in blokirajo njihovo vezavo na komplementarne molekule eritrocitov.

V zadnjem času se reakcija pogosto uporablja v kliničnih viroloških laboratorijih za določanje titrov specifičnih protiteles proti nekaterim virusom, pa tudi za serološko identifikacijo in tipizacijo izolatov virusa iz kliničnega materiala bolnikov.

Uporabljajo se nekoliko omejeno zaradi prisotnosti v krvnem serumu ljudi nespecifičnih zaviralcev virusov, pa tudi naravnih protiteles - aglutininov.

Reakcija nevtralizacije je reakcija zaviranja hemaglutinacije (RTGA).

Uporablja se RTGA:
-za serotipizacijo virusov;
- za serodiagnozo okužb.
Obstajata dva načina uprizoritve:
- kapalna metoda na steklo (približna reakcija), ki se uporablja za sivo kopiranje virusov;
- razvito v epruvetah.

Mehanizem.

Nekateri virusi (na primer gripa) vsebujejo hemaglutinin, ki pri različnih živalih povzroči aglutinacijo rdečih krvnih celic, odvisno od vrste virusa.

V prisotnosti protiteles v serumu - antihemaglutininov, opazimo zaviranje aktivnosti virusov.
RTGA.
Cilj: Serotipiziranje virusa influence A

Sestavine:
1. Preskusni material - alantoična tekočina piščančjega zarodka,
2. Diagnostični serum proti gripi, specifičen za tip,
3,5% suspenzija piščančjih eritrocitov.
4.

Fiziološka raztopina.

Reakcijo damo na steklo po kapljici. Na steklo nanesite 1 kapljico diagnostičnih serumov in preskusnega materiala, premešajte, nato dodajte 1 kapljico suspenzije eritrocitov. Pri pozitivni reakciji opazimo homogeno pordelost, pri negativni reakciji pa izpadejo rdeči kosmiči (hemaglutinacija).

PrejšnjiNaslednji

Značilnosti virusov gripe. Epidemiologija in diagnoza gripe. Uporaba RTGA za serotipizacijo virusov gripe. Priprave za specifično profilakso in zdravljenje.

Gripa ali gripa - akutna okužbe za katero je značilna poškodba sluznice zgornjega dela dihalnega trakta, zvišana telesna temperatura, splošna zastrupitev, oslabljena aktivnost srčno -žilnega in živčnega sistema.

Za gripo je značilna nagnjenost k epidemičnemu in pandemičnemu širjenju zaradi visoke nalezljivosti in variabilnosti patogena.

Značilnosti patogenov. V to spadajo patogeni - virusi gripe. Orthomyxoviridae, rodovi Influenzavirus A, B in Influenzavirus C. Virusi gripe so virusi RNA. Virus gripe tipa A so leta 1933 izolirali W. Smith, K. Andrews, P. Laidlaw. Leta 1940 je T.

Uporaba metode hemaglutinacije v virologiji.

Francis in R. Medgill sta izolirala viruse gripe tipa B, leta 1949 R. Taylor - tip C. V Rusiji so prve viruse gripe leta 1936 izolirali A. A. Smorodintsev in jih razvrstili kot tip A. Morfologija. Virusi gripe imajo sferično obliko (oblika kroglice) - 80 - 120 nm, redkeje imajo nitasto obliko. Sestavljajo jih: 1) jedro -nukleokapsid spiralnega tipa simetrije (enoverižna linearna " -" -niz RNA + proteinska kapsida); 2) bazalna membrana - zunanja lipoproteinska membrana - superkapsid.

Na površini ovojnice sta dve vrsti glikoproteinov (v obliki trnja in resic): 1) hemaglutinin - spodbuja vezavo na celične receptorje; 2) neuraminidaza - spodbuja sproščanje virusa iz celice. Gojenje. Za gojenje se uporabljajo piščančji zarodki, primarne tripsinizirane celične kulture in včasih laboratorijske živali.

Najprimernejši model so piščančji zarodki, stari 10-12 dni. Omogoča vam, da dobite velike količine virusa, ki je potreben pri proizvodnji cepiv in bakterijskih pripravkov.

Okužba se izvaja v alontojski votlini, v horionsko-alontoični membrani, v amnijski votlini, v amnionu. Prisotnost virusa v piščančjem zarodku zaznamo v reakciji hemaglutinacije. Antigenska struktura. Virusi imajo notranji antigen-S in površinske antigene: HA-hemaglutinin in NA-neuraminidazo. S-antigen je za skupino specifičen, skupni celotnemu tipu, saj so virusi gripe za ta antigen razdeljeni na vrste A, B in C. Je komplemen vezan, stabilen (nespremenjen) antigen.

Antigena HA in NA sta specifična antigena. Antigen HA povzroča nastanek protiteles, ki nevtralizirajo virus, in adhezijo eritrocitov.

Antigen NA povzroča nastanek protiteles, ki delno nevtralizirajo viruse.

Virus tipa B je manj spremenljiv, tip C pa zelo stabilen.

Strupene lastnosti. Toksični učinek virusa na telo ( glavobol, bolečine v mišicah, temperatura, kataralni pojavi) povzročajo beljakovine virusa (najbolj virusni delec). To dejanje je strogo specifično in ga nevtralizira le imunski serum ustrezne vrste ali podtipa ali serum bolnikov. Odpornost. Virusi gripe so občutljivi na UV -žarke, razkužila (formalin, alkohol, fenol, kloramini) in topila v maščobi.

V tekočem mediju umrejo pri temperaturi 50 - 60 ° C v nekaj minutah. Pri sobni temperaturi v zraku virusi ostanejo nalezljivi več ur. Dolgo se hranijo v posušeni obliki, v zamrznjenem stanju (-70 ° C) pa ne le, da ostanejo dlje časa, ampak tudi ne izgubijo virulence.

Dovzetnost živali. V naravnih razmerah virusi tipa A okužijo ljudi in živali (konji, prašiči zbolijo), virusi tipa B in C pa samo ljudi. Med laboratorijskimi živalmi so bele viruse dovzetne bele miši, afriški beli dihurji, sirski hrčki in opice.

Za bolezen pri živalih je značilna poškodba pljuč, vročinsko stanje in lahko povzroči smrt živali. Epidemiologija bolezni. Vir okužbe je bolna oseba s klinično izraženo ali asimptomatsko obliko. Bolnik sprošča virus v okolje, ko kašlja, govori, kiha s kapljicami sline, sluzi, sputumom že v inkubacijskem obdobju.

Bolnik postane nalezljiv 24 ur pred pojavom glavnih simptomov in predstavlja nevarnost epidemije v 48 urah po njihovem izginotju.

Mehanizem prenosa je aerogen. Prenosna pot je po zraku. Ljudje smo zelo dovzetni za gripo. Vse starostne skupine so bolne, predvsem pozimi. Najbolj dovzetni so otroci in starejši. Ime bolezni odraža značilnosti epidemiologije: gripa iz francoščine. prijemalo - zgrabiti, gripa - iz italijanščine. Gripa di freddo - vpliv mraza.

Od vseh ostrih bolezni dihal gripa je najbolj razširjena in resna bolezen. Pandemije in epidemije gripe zajemajo do 30-50% ali več svetovnega prebivalstva, kar povzroča ogromno škodo zdravju in gospodarstvu držav. Prvi opisi epidemij gripe segajo v 12-14. Pojav pandemij in velikih epidemij povzroča virus gripe tipa A, ki je posledica velike variabilnosti virusa in je povezan s pojavom novega podtipa kot posledica premika antigena.

Med pandemijami se epidemije pojavljajo vsakih 1,5-2 leta, kar je povezano z antigenskim odnašanjem virusov. Leta 1918 je pandemijo španske gripe (zbolelo 1,5 milijarde ljudi, umrlo 20 milijonov) povzročil virus gripe A1. Ta pandemija, ki je bila primarno registrirana v Španiji, je zajela skoraj celotno prebivalstvo Zemlje; za bolezen je bil značilen razvoj izjemno hude hemoragične pljučnice z rekordno umrljivostjo (do 1% vseh primerov).

Leta 1957 je "azijsko" pandemijo (zbolelo 2 milijardi ljudi) povzročil nov podtip - podtip A2. Leta 1968 je pandemijo "Hong Kong" (zbolela 1 milijarda ljudi) povzročil na novo nastali podtip - podtip A3. Nova varianta virusa praviloma izpodrine prejšnjo krožno sorto iz človeške populacije.

Toda leta 1977 se je po 20-letnem premoru tip A1 nenadoma "vrnil", kar je privedlo do velike epidemije. Posledično se razseljene variante virusa gripe vztrajajo in lahko v določenih časovnih presledkih znova povzročijo epidemijo. Virus tipa B povzroča lokalne epidemije, tip C pa ne povzroča epidemij. Patogeneza in klinična slika bolezni. Vhodna vrata so zgornje dihalne poti. Virus vdre v epitelne celice sluznice in se v njih razmnožuje.

Vpliv virusa na epitelne celice povzroči njihovo nekrozo in deskvamacijo (zavrnitev) epitelija, zaradi česar sluznica postane prepustna za viruse in bakterije. Vstopijo v krvni obtok in se razširijo po telesu. «Viremijo spremljajo večkratne lezije kapilarnega endotela s povečanjem njihove prepustnosti.

V hudih primerih pride do obsežnih krvavitev v pljučih, miokardu, parenhimskih organih. Produkti razpadanja poškodovanih celic in virusne beljakovine imajo toksičen učinek na različne organe in organske sisteme. Virusni toksini močno zavirajo centralni živčni sistem, in čeprav proces ne traja dolgo (3 - 5 dni), bo bolnik dolgo časa oslabljen, oslabljenemu telesu pa se pridruži še kakšna sekundarna okužba in nastanejo zapleti: pljučnica gripe, akutna pljučni edem, poškodbe ledvic, srca, bronhijev.

Pogost zaplet gripe je bakterijska pljučnica (streptokoki skupine B). Med pandemijo španske gripe so ljudje umirali predvsem zaradi sekundarne bakterijske pljučnice.

V patogenezi gripe ni pomembna le zastrupitev, temveč tudi alergizacija, pa tudi kršitev funkcionalnih lastnosti imunsko kompetentnih celic z razvojem imunske pomanjkljivosti. Inkubacijska doba- več ur - 1-3 dni. Zanj je značilen akutni začetek, zvišanje temperature na 37,5 - 38 ° C, splošna zastrupitev, izražena v slabo počutje, glavobol, bolečine v zrkla, vnetni procesi dihal različne stopnje (rinitis, laringitis, traheitis, faringitis).

Vročina z gripo brez zapletov traja 5-6 dni. Imuniteta. Po preneseni bolezni se oblikuje za tip značilna in za sev specifična imunost, ki jo zagotavljajo specifični in nespecifični celični in humoralni dejavniki. Zelo pomembna so protitelesa Ig A. Križna imunost se ne razvije, po prenosu gripe tipa A1 lahko zbolite za gripo tipa A2 itd. Po virusu tipa je imuniteta 1-2 leti, po virusu tipa B - 3 - 5 let.

Pasivna naravna imunost - pri otrocih, mlajših od 8 do 11 mesecev. Zaradi velike antigenske variabilnosti virusa okrevanje ne vodi do razvoja trajne odpornosti na ponavljajoče se okužbe.

Laboratorijska diagnostika. Preskusni material: bris-odtisi iz sluznice nosne votline, izcedek iz nazofarinksa, kosi pljuč, možgani v primeru smrti.

Diagnostične metode: 1) metoda citorinoskopije - odkrivanje znotrajceličnih vključkov, značilnih za virus - pri obarvanju s pioktaninom pod mikroskopom so v celicah ciliarnega epitelija vidni svetlo rdeči vključki virusa gripe; 2) virološka metoda - izolacija virusa gripe iz človeškega telesa z okužbo piščančjih zarodkov z izpiranjem iz bolnikovega nazofarinksa; navedbo (prisotnost) virusa izvajamo s pomočjo RHA (virusi gripe aglutinirajo eritrocite ljudi in različnih živali), identifikacijo virusa izvajamo po stopnjah: tip se določi v RSC, podtip hemaglutinina - v RTGA in podtipu neuraminidaze - v reakciji zaviranja aktivnosti encima; 3) serološka metoda - odkrivanje povečanja titra (4 -krat) specifičnih protiteles v krvnem serumu bolnika z uporabo RSK, RTGA, RN v celični kulturi, reakcija obarjanja v gelu, ELISA; 4) biološka metoda - intranazalna okužba miši - vnos materiala v pljuča pod etersko anestezijo; miši umrejo po 2 do 3 dneh zaradi pljučnice; 5) hitra diagnostika - odkrivanje virusnega antigena z uporabo RIF.

Zdravljenje in preprečevanje.

Za preprečevanje in zdravljenje v prvih dneh bolezni se uporablja humani levkocitni interferon (intranazalno). V medicinske namene uporaba protivirusna zdravila- remantadin (gripa tipa A), adapromin, virazol in imunomodulatorna zdravila - dibazol, prodigiosan, levomizol.

Pri hudi gripi, zlasti pri otrocih, se uporablja donorski imunoglobulin proti gripi, pa tudi zdravila - zaviralci celičnih proteaz (gordoks, contrikal, aminokaprojska kislina).

Posebna profilaksa. Uporabljajo se naslednja protivirusna zdravila in imunomodulatorji ter cepiva - živa in inaktivirana: 1) živa monovakcina za peroralno dajanje - oslabljeni sevi virusov, ki trenutno krožijo (A1, A3 in B); kažejo največjo imunogenost; 2) celovita virionska cepiva iz virulentnih sevov, inaktiviranih s formaldehidom ali UV -žarki; 3) cepiva proti podenoti proti gripi samo iz površinskih antigenov - HA in NA -antigenov (imajo minimalno reaktogenost).

Za pridobitev cepiv se virusi gojijo v zarodkih piščancev in v celični kulturi piščančjih zarodkov.

Z uvedbo cepiv se oblikuje lokalna in humoralna imunost. Cepljenje se izvaja v obdobjih največje nevarnosti epidemij. Najpogosteje je indicirano za mlade in stare ljudi. Uporaba ubiti cepiv zahteva letno cepljenje; njihova učinkovitost ne presega 60 - 70%.

Ker Ker pogosto opazimo antigenske variacije patogena, je mogoče nabor antigenov ustreznega virusa za imunizacijo določiti šele po nastopu izbruha.

Vstopnica 15.

Reakcija hemaglutinacije (RHA).

V laboratoriju uporabljajo dve reakciji hemaglutinacije, ki se po mehanizmu delovanja razlikujejo.

Prva RHA je serološka. Pri tej reakciji se rdeče krvne celice pri interakciji z ustreznimi protitelesi (hemaglutinini) aglutinirajo.

Reakcija se pogosto uporablja za določanje krvnih skupin.

Drugi RHA ni serološki. V njem adhezija eritrocitov ni povzročena

protitelesa in posebne snovi, ki jih tvorijo virusi. Na primer, virus gripe aglutinira eritrocite piščancev in morskih prašičkov, virus poliomielitisa - eritrocite ovac. Ta reakcija omogoča presojo prisotnosti določenega virusa v preskusnem materialu.

Reakcijo izvedemo v epruvetah ali na posebnih ploščah z luknjami.

Material, ki ga je treba testirati na prisotnost virusa, razredčimo z izotonično raztopino od 1:10 do 1: 1280; 0,5 ml vsake razredčitve zmešamo z enakim volumnom 1-2% suspenzije eritrocitov. Pri kontroli se 0,5 ml eritrocitov zmeša z 0,5 ml izotonične raztopine. Epruvete postavimo v termostat za 30 minut, plošče pa pustimo pri sobni temperaturi 45 minut.

Računovodstvo rezultatov. Ob pozitiven rezultat reakcija na dnu epruvete ali vdolbinice izpade oborina eritrocitov z okrašenimi robovi ("dežnik"), ki pokriva celotno dno vdolbinice.

Reakcija zaviranja hemaglutinacije

Če je rezultat negativen, eritrociti tvorijo gosto usedlino z gladkimi robovi ("gumb"). Isti sediment bi moral biti pod nadzorom.

Intenzivnost reakcije je izražena z znaki "+". Titr virusa je največja razredčitev materiala, v katerem pride do aglutinacije.

Reakcija zaviranja hemaglutinacije

To je serološka reakcija, pri kateri specifična protivirusna protitelesa v interakciji z virusom (antigenom) nevtralizirajo in mu odvzamejo sposobnost aglutinacije eritrocitov, t.j.

To pomeni, da zavirajo reakcijo hemaglutinacije. Ta reakcija vam omogoča, da določite vrsto in vrsto virusov.

Izjava o reakciji. 0,25 ml protivirusnega seruma zmešamo z enako količino materiala, ki vsebuje virus. Zmes pretresemo in postavimo v termostat 30 minut, nato dodamo 0,5 ml'1-2% suspenzije eritrocitov.

Računovodstvo rezultatov. S pravilno nastavitvijo poskusa pri nadzoru seruma in eritrocitov je treba oblikovati "gumb" - ni faktorja, ki bi aglutiniral eritrocite; pri nadzoru antigena nastane "dežnik" - virus je povzročil aglutinacijo eritrocitov.

Če je serum homologen preučevanemu virusu, nastane "gumb" - serum je nevtraliziral virus.

Posredna reakcija hemaglutinacije

Posredna (pasivna) reakcija hemaglutinacije (RIGA) temelji na dejstvu, da eritrociti, če je topni antigen adsorbiran na njihovi površini, pridobijo sposobnost aglutinacije pri interakciji s protitelesi proti adsorbiranemu antigenu.

Izjava o reakciji.

Serum segrevamo 30 minut pri 56 ° C, zaporedoma razredčimo v razmerju 1:10 - 1: 1280 in vlijemo v 0,25 ml epruvete ali vdolbinice, kamor nato dodamo 2 kapljici eritrocitov z adsorbiranimi antigeni.

Nadzor: suspenzija eritrocitov z antigeni, adsorbiranimi na njih z očitno imunskim serumom, suspenzija eritrocitov z antigeni, adsorbiranimi na njih z normalnim serumom; suspenzija normalnih eritrocitov s testiranim serumom.

Pri prvem nadzoru bi se morala zgoditi aglutinacija, pri drugem in tretjem pa ne bi smelo biti.

Kontrolna vprašanja.

1. Kaj kaže pozitiven rezultat RHA med eritrociti in materialom, testiranim na prisotnost virusa?

2. Ali bo prišlo do reakcije aglutinacije eritrocitov, če jim dodamo virus in ustrezen serum?

Kako se imenuje reakcija, ki razkriva ta pojav?

PRAKTIČNO DELO št. 12.

Reakcija vezave komplementa.

Reakcija vezave komplimentov (CSC) temelji na dejstvu, da specifičen kompleks antigen-protitelo vedno adsorbira (veže) komplement nase.

Ta reakcija se pogosto uporablja pri identifikaciji antigenov in pri serodiagnozi okužb, zlasti bolezni, ki jih povzročajo spirohete (Wassermanova reakcija), rikecija in virusi.

RCC-kompleksna serološka reakcija.

Vključuje komplement in dva sistema antigen-protitelesa. V bistvu gre za dve serološki reakciji.

Pravi sistem - glavni - sestoji iz antigena in protitelesa (eno je znano, drugo ne). Doda se mu določena količina komplementa. Ko se antigen in protitelesa tega sistema ujemajo, bodo združili in vezali kompliment. Nastali kompleks je fino razpršen in ni viden.

Nastanek tega kompleksa se prepozna s pomočjo drugega hemolitičnega ali indikatorskega sistema.

Vključuje ovčje eritrocite (antigen) in ustrezen hemolitični serum (protitelo), tj. že pripravljen imunski kompleks. V tem sistemu se lahko liza rdečih krvnih celic pojavi le v prisotnosti komplementa. Če je komplement vezan na prvi sistem, potem v drugem sistemu ne bo hemolize;

brez brezplačnega dopolnila. Odsotnost hemolize (vsebina epruvete je motna ali na dnu usedline eritrocitov) se zabeleži kot pozitiven rezultat CSC.

Če v prvem sistemu antigen ne ustreza protitelesu, potem imunski kompleks ne nastane in kompliment ostane prost. Ko ostaja prost, kompliment sodeluje v drugem sistemu in povzroči hemolizo, rezultat CSC je negativen (vsebina epruvet je prozorna "lakirana kri").

Komponente, vezavne reakcije komplementa:

Antigen - običajno lizat, ekstrakt, hapten,

redkeje suspenzija mikroorganizmov.

2. Serum protitelesa - bolnik.

3. Komplement - serum morskih prašičkov.

Antigen - ovčji eritrociti.

5. Protitelesa - hemolizin proti eritrocitom ovac.

6. Izotonična raztopina.

Ker je v DGC vključenih veliko kompleksnih komponent,

jih je treba predhodno titrirati in vnesti v reakcijo v natančnih količinah in v enakih količinah: po 0,5 ali 0,25, redkeje 0,2,1,25 ali 1,0 ml (velike količine dajejo natančnejši rezultat). Titracijo reakcijskih komponent izvedemo v istem volumnu kot poskus, pri čemer manjkajoče sestavine nadomestimo z izotonično raztopino.

Podobne informacije:

Iščite na spletnem mestu:

Temelji na dejstvu, da eritrociti, na katerih so predhodno adsorbirani antigeni, pridobijo sposobnost aglutinacije v prisotnosti homolognih serumov (protiteles).

V tem primeru eritrociti delujejo kot nosilci s posebnimi determinantami, katerih aglutinacija nastane kot posledica reakcije antigen + protitelo.

Eritrociti, na površino katerih so antigeni trdno pritrjeni, se imenujejo eritrocitni antigeni diagnostiki ali eritrociti, občutljivi na antigen.

Druga vrsta protiteles RNGA se adsorbira na površini eritrocitov in njihova kasnejša aglutinacija se pojavi v prisotnosti homolognega antigena.

V tem primeru se takšni eritrociti imenujejo diagnostiki za protitelesa proti eritrocitom ali eritrociti, občutljivi na protitelesa.

Na podlagi teh dveh temeljnih metodoloških pristopov so bile razvite in se uporabljajo številne spremembe RNGA. Tako se kot nosilci uporabljajo majhni standardni delci lateksa.

Reakcija zaviranja hemaglutinacije (RTGA)

V tem primeru se reakcija imenuje lateksna aglutinacijska reakcija (RLA) ali se uporablja Staphylococcus aureus - koaglutinacijska reakcija itd. Običajno se diagnostika eritrocitov pripravi v podjetjih biološke industrije, v diagnostičnih laboratorijih pa so že postavili glavne izkušnje RNGA.

Priprava diagnostike eritrocitov vključuje naslednje korake:

• fiksacija eritrocitov s formaldehidom ali glutaralnimi ali akrilnimi aldehidi.

  Tako obdelani eritrociti trajajo dlje časa. Najpogosteje se v ta namen uporabljajo eritrociti ovna, ljudi, piščancev itd.

• zdravljenje fiksnih eritrocitov z raztopino tanina. Zaradi tega eritrociti pridobijo lastnost, da na svoji površini nepovratno adsorbirajo beljakovine (viruse in protitelesa);
• preobčutljivost strojenih eritrocitov z virusi ali protitelesi.

Treba je opozoriti, da so metode za pripravo diagnostike eritrocitov za virusne okužbe različne.

Tehnika nastavitve RNGA za odkrivanje in določanje titra protiteles je naslednja:

• enake doze eritrocitov, občutljivih na antigen, dodamo v serijske 2-kratne razredčitve seruma;
• zmes pustimo 2-3 ure pri sobni temperaturi ali 16-18 ur pri 4 ° C;
• upoštevajte rezultate.

  Če serum vsebuje protitelesa proti virusu, ki je povzročil preobčutljivost eritrocitov, opazimo hemaglutinacijo, ki jo ovrednotimo na križancih.

Za titer protiteles v serumu se vzame najvišja razredčitev seruma, ki še vedno zagotavlja hemaglutinacijo z vsaj dvema križanjema.

RNGA spremljajo vse ustrezne kontrole. Običajno reakcijo izvajamo z mikrometodo.

RNGA vam omogoča, da rešite naslednje diagnostične naloge:

• odkrivanje protiteles in določitev njihovega titra v krvnem serumu z uporabo znanega antigenskega diagnostika za eritrocite;
• odkriti in identificirati neznanega virusa z uporabo znanega diagnostika za protitelesa proti eritrocitom.

Prednosti RNGA: visoka občutljivost, preprostost nastavitvene tehnike in hiter odziv.

Pomembno pa je omeniti, da obstajajo velike težave pri pripravi stabilne diagnostike eritrocitov (velika odvisnost od čistosti uporabljenih komponent, potreba po izbiri načina fiksacije, tanizacija in senzibilizacija eritrocitov za vsako vrsto virusa).

Če najdete napako, izberite del besedila in pritisnite Ctrl + Enter.

V stiku z

sošolci

Uporablja eritrocite ali nevtralne sintetične materiale (na primer lateksne delce), na površini katerih se sortirajo antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ali protitelesa.

Do njihove aglutinacije pride, ko dodamo ustrezne serume ali antigene. Eritrociti, občutljivi na antigene, se imenujejo diagnostika antigenskih eritrocitov in se uporabljajo za odkrivanje in titriranje protiteles. Eritrociti, občutljivi na protitelesa. imenujemo diagnostiki imunoglobulinskih eritrocitov in se uporabljajo za odkrivanje antigenov.

Reakcija pasivne hemaglutinacije se uporablja za diagnosticiranje bolezni, ki jih povzročajo bakterije (tifus in paratifus, griža, bruceloza, kuga, kolera itd.), Protozoji (malarija) in virusi (gripa, okužbe z adenovirusi, virusni hepatitis B, ošpice, klopni encefalitis, krimska hemoragična mrzlica itd.), Pa tudi za določitev nekaterih hormonov, za ugotavljanje pacientove preobčutljivosti na zdravila in hormone, kot sta penicilin in insulin.

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA).

Reakcija pasivne hemaglutinacije je občutljiva metoda serološke diagnoze in se uporablja tako za zgodnjo kot za retrospektivno diagnostiko, pa tudi za ugotavljanje imunopoetskega stanja cepljenih. Pri bolnikih s tularemijo se protitelesa običajno odkrijejo ob koncu 1. ali 2. tedna bolezni, po 1-1,5 mesecih titri RPHA dosežejo največje vrednosti (1: 100000-1: 20.000, redkeje višje), po ki se znižajo na ravni 1: 100-1: 200, se hranijo dlje časa.

Pri cepljenih se protitelesa nenehno odkrivajo, vendar pri nižjih titrih, ki ne presegajo 1: 2000-1: 5000 1-1,5 mesecev po cepljenju, ostanejo nekaj let na nizki ravni 1: 20-1: 80.

Diagnostik eritrocitov tularemije (antigen) se uporablja kot antigen za nastavitev RPHA.

Zdravilo je formalizirani ovčji eritrociti, občutljivi na antigen tularemije, proizveden v tekoči in suhi obliki. Tekoči pripravek - 10% suspenzija eritrocitov v 10% koncentracijski raztopini formalina. Suh liofiliziran pripravek - vakuumsko sušena 10% suspenzija eritrocitov brez konzervansa. Pred uporabo ga razredčimo v skladu z navodili na etiketi. Za nastavitev reakcije v polistirenskih ploščah se obe zdravili uporabljata v 2,5% koncentraciji, pri nastavitvi reakcije v mikrovolumentih pa v 0,5% koncentraciji.

Tehnika uprizoritve RPGA.

Testirane serume razredčimo s fiziološko raztopino 1: 5 (1:10) in segrevamo 30 minut pri 56 ° C.

Reakcija hemaglutinacije (RHA) in

Po tem se serumi za odstranitev heterogenih protiteles proti jagnječjim eritrocitom obdelajo s 50% suspenzijo formaliziranih jagnječjih eritrocitov. Za to dodamo eritrocite s hitrostjo 2 kapljic (po 0,05 ml vsaka) na 1 ml seruma in s stresanjem temeljito premešamo.

Serum pustimo, dokler se eritrociti popolnoma ne usedejo, ali centrifugiramo po eni uri pri sobni temperaturi, nato pa je pripravljen za raziskave.

Razredčevalna tekočina se v prostornini 0,5 ml vlije v vrsto vdolbinic iz polistirenske plošče.

Pri predhodni študiji serumov jih je priporočljivo preizkusiti tako, da reakcijo nastavimo v kratki vrsti plošče (6 vdolbinic). Če se protitelesa odkrijejo v kratki vrsti, se serumi ponovno testirajo v dolgi vrsti za redčenje (12 vdolbinic).

Po razlitju razredčevalne tekočine dodajte 0,5 ml testiranega seruma v razredčitvi 1: 5 v prvo jamico vsake vrstice (kratko ali dolgo). Nato v istih količinah seruma titrirajte z dvojnimi razredčitvami. Tako dobimo serumske razredčitve v kratkih serijah od 1:10 do 1: 320 in v dolgih serijah od 1:10 do 1: 20480. Po titraciji serumov v vsako jamico dodamo eno kapljico (0,05 ml) delujoče 2,5% suspenzije senzibiliziranih eritrocitov.

Vsebino plošč temeljito pretresite, dokler ne dobite homogene suspenzije. Plošče pustimo pri sobni temperaturi na nepremični površini mize. Predhodna registracija reakcije se izvede po 2-3 urah, končna določitev titra se izvede po popolni sedimentaciji eritrocitov v vdolbinicah. Za reakcijo so predvidene naslednje kontrole: 1) preskusni serum v razredčitvi 1:10 v prostornini 0,5 ml + 1 kapljica 2,5% suspenzije nesenzibiliziranih eritrocitov; 2) razredčitvena tekočina v prostornini 0,5 ml + 1 kapljica 2,5% suspenzije nesenzibiliziranih eritrocitov; 3) razredčitvena tekočina v prostornini 0,5 ml + 1 kapljica 2,5% suspenzije preobčutljivih eritrocitov.

Vse kontrole morajo biti očitno negativne.

Računovodstvo in vrednotenje RPGA. Reakcijo ocenjujemo po naslednji shemi:

1) ostro pozitivna reakcija (++++) - eritrociti padajo na dno luknje v enotni plasti v obliki "dežnika", ki ima pogosto pokrovaste robove;

2) pozitivna reakcija (+++) - rdeče krvne celice pokrivajo vsaj 2/3 dna vrtine;

3) šibko pozitivna reakcija (++) - aglutinat je majhen in se nahaja v samem središču vrtine;

4) dvomljiva reakcija (+) - okoli sedimenta eritrocitov v samem središču luknje so ločena zrna aglutinata;

5) negativno ( -) - na dnu luknje se eritrociti usedejo v obliki "gumba" ali majhnega obroča z gladkimi, ostro opredeljenimi robovi.

Serumski titer se upošteva glede na zadnjo redčenje seruma, kar je dalo povsem jasno reakcijo (vsaj tri pluse).

Razredčenje 1: 100 in več velja za diagnostični titer, vendar je tako kot pri RA potrebno spremljati njegovo povečanje.

RPHA pri tularemiji je precej specifična in kaže nekatere navzkrižne reakcije le s serumi bruceloze. Diferencialna diagnoza možno zaradi višine titrov v RPHA, ki so pri homolognem antigenu bistveno višji.

Tehnika nastavitve RPGA v mikrovolumih.

RPHA je mogoče izvesti v mikrovolumih z uporabo mikrotiterja tipa Takachi (ali mikrotitrskih plošč z okroglim dnom z mikropipetami), ki omogoča titracijo materiala v prostornini 25 μl in 50 μl. Tehnika nastavitve reakcij, zaporedje vseh operacij je enako kot pri študiji na polistirenskih ploščah. Upoštevati pa je treba, da je občutljivost mikrometode običajno ena razredčitev (t.j.

2 -krat) nižja od makro metode.

Za nastavitev reakcije v mikrotiterju v vsako vdolbino s kapalno pipeto vnesemo razredčeno tekočino v prostornini 50 μl. Nato z uporabo titratorjev z glavo 50 μl vzamemo preskusni serum tako, da vanj potopimo glavo.

Prepričajte se, da je tekočina napolnila glavo titratorja. Prenesite titrator s serumom v prvo vdolbino in ga držite v pokončnem položaju, naredite več rotacijskih gibov v obe smeri. Nato se titrator prenese v naslednjo vdolbino in manipulacija se ponovi. Titriranje se lahko izvede hkrati v več vrstah. Po titriranju celotne vrstice se titrator spere z destilirano vodo (s spremembo 2 porcij) z vrtljivimi gibi, voda se z brisom odstrani iz glave in sežge na plamenu gorilnika.

Po titraciji v vdolbinice dodamo 25 μl diagnostika eritrocitov.

Koncentracija diagnostika za RPHA v mikro volumnih mora biti 0,5% (to pomeni, da se 2,5% suspenzija eritrocitov dodatno razredči 5 -krat). Po dodajanju eritrocitov je treba plošče nežno pretresati, dokler ne dobimo homogene suspenzije. Rezultate je mogoče zabeležiti v 1-1,5 urah, kar je pomembna prednost RPHA v mikrotiterju.

Poleg tega ta tehnika zahteva majhno količino vseh reakcijskih sestavin in testnih serumov.

Reakcija se upošteva po naslednji shemi:

1) "+" - polnopravna hemaglutinacija, pri kateri eritrociti padajo na dno luknje v enakomerni plasti v obliki "dežnika", ki zasedajo najmanj 2/3 dna;

2) "+ -" - delna hemaglutinacija, pri kateri eritrociti padejo na dno v obliki ohlapnega obroča majhne velikosti;

3) " -" - odsotnost hemaglutinacije, ko eritrociti padejo na dno v obliki majhnega gumba ali obročka z enakomernim robom.

Specifičnost pozitivnega rezultata, pridobljenega pri RPHA, je mogoče preveriti z uporabo trikomponentne reakcije - reakcije pasivne inhibicije hemaglutinacije (RPHA).

Tehnika uprizarjanja RTPGA.

Ta reakcija se uporablja za potrditev posebnosti pozitivnega rezultata RPHA, kadar je vprašljiv ali ima poseben epidemiološki interes. Reakcijski mehanizem je sestavljen iz posebne inhibicije hemaglutinacije, ko se v testni serum doda suspenzija ubijenih bakterij tularemije. V reakciji sodelujejo tri komponente: testirani serum, specifični antigen tularemije in antigenski eritrocitni diagnostik RTPHA so običajno postavljeni v vrsto 7-8 vdolbinic.

Priporočljivo je, da vzporedno z RTPHA namestite drugi RPGA. 0,25 ml razredčevalne tekočine vlijemo v dve vrsti vdolbinic, nato pa v prve vdolbinice obeh vrstic dodamo preskusni serum v prostornini 0,25 ml in titriramo. Dobimo dve enaki seriji razredčitev seruma. V vse vdolbinice druge vrste dodajte 0,25 ml razredčevalne tekočine, v vdolbinice prve vrste pa 0,25 ml suspenzije bakterij tularemije.

Uporablja se diagnostični tularemija (ki vsebuje 25 milijard bakterij tularemije v 1 ml), predhodno razredčena 50 -krat.

Ta suspenzija vsebuje 500 milijonov bakterij v 1 ml ali 125 milijonov v prostornini 0,25 ml. Po dodajanju antigena ploščo pustimo 1 uro pri sobni temperaturi, nato dodamo eno kapljico (0,05 ml) diagnostika eritrocitov v vse jamice obeh vrst, ploščo stresemo in pustimo na ravni površini mize.

Računovodstvo se izvede v 2-3 urah.

Računovodstvo in ocena RTPHA. Če testni serum vsebuje specifična protitelesa proti tularemiji, jih nevtralizira dodani antigen in do hemaglutinacije ne bo prišlo v prvi vrsti jamic ali pa bo pri visokem serumskem titru hemaglutinacija zabeležena v manjšem (za 2-4) številu vrtin kot v vrsti z RPHA. V tem primeru se potrdi posebnost rezultatov.

Če opazimo hemaglutinacijo v obeh vrsticah, tj. rezultati RTPHA in RPHA sovpadata, kar kaže na odsotnost protiteles proti tularemiji v testiranem serumu. V tem primeru se primarni rezultat RPHA prizna kot nespecifičen.

Tehnika nastavitve RTPGA v mikrovolumih. RTPHA, pa tudi RPHA, lahko izvajamo v mikrovolumih z uporabo mikrotitarja tipa Takachi.

V ta namen se 0,25 μl razredčevalne tekočine vnese v vdolbinice mikroplošč v dveh vrstah po 7-8 vdolbinic. Nato z uporabo titratorja v obeh vrstah odštejemo 0,25 μl testnega seruma in titriramo. Po tem se v vsako jamico v prvi vrsti doda 25 μl antigena tularemije (katere koncentracija je 500 milijonov bakterij tularemije v 1 ml), v drugo pa 25 μl razredčevalne tekočine.

Plošče pustimo 1 uro pri sobni temperaturi, nato pa v vse vdolbinice obeh vrst dodamo 25 μl diagnostičnega antigenskega spektrocita (0,5% koncentracija).

Rezultati se upoštevajo in ovrednotijo ​​na podoben način kot reakcija v makro volumenih.

Datum objave: 2015-02-03; Preberite: 3176 | Kršitev avtorskih pravic strani

studopedia.org - Studopedia.Org - 2014-2018. (0,003 s) ...

Reakcija zaviranja hemaglutinacije (RTGA) je metoda za identifikacijo virusa ali odkrivanje protivirusnih protiteles v krvnem serumu pacienta, ki temelji na pojavu odsotnosti aglutinacije eritrocitov z zdravilom, ki vsebuje virus, v prisotnosti seruma, imunskega nanj.

Reakcija zaviranja hemaglutinacije (RTGA) temelji na blokadi, zatiranju virusnih antigenov s protitelesi imunskega seruma, zaradi česar virusi izgubijo sposobnost aglutiniranja eritrocitov.

RTGA se uporablja za diagnosticiranje številnih virusnih bolezni, katerih povzročitelji (gripa, ošpice, rdečke, virusi klopnega encefalitisa itd.) Lahko aglutinirajo eritrocite različnih živali.

Mehanizem. Tipizacija virusa se izvede v reakciji inhibicije hemaglutinacije (RTGA) z nizom tip-specifičnih serumov. Rezultati reakcije se upoštevajo zaradi odsotnosti hemaglutinacije.

Podtipe virusa A z antigeni H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 in drugimi je mogoče v RTGA razlikovati z nizom homolognih za tip specifičnih serumov.

Reakcija vezave komplementa. Mehanizem. Sestavni deli. Uporaba

Reakcija vezave komplementa (CSC) je ta, da ko se antigeni in protitelesa medsebojno ujemajo, tvorijo imunski kompleks, na katerega je komplement (C) vezan preko Fc-fragmenta protiteles, torej je komplement vezan na antigen-protitelo zapleteno. Če kompleks antigen-protitelo ne nastane, ostane komplement prost.

Specifično interakcijo AG in AT spremlja adsorpcija (vezava) komplementa. Ker se proces vezave komplementa ne manifestira vizualno, sta J. Bordet in O. Zhangu predlagala uporabo hemolitičnega sistema (ovčji eritrociti + hemolitični serum) kot indikator, ki kaže, ali komplement fiksira kompleks AG-AT. Če se AG in AT ujemata, to pomeni, da nastane imunski kompleks, potem je komplement vezan s tem kompleksom in do hemolize ne pride. Če AT ne ustreza AH, se kompleks ne tvori in komplement, medtem ko ostane prost, se poveže z drugim sistemom in povzroči hemolizo.

Sestavni deli. Test fiksiranja komplementa (CSC) je zapletena serološka reakcija. Za njegovo izvedbo je potrebnih 5 sestavin, in sicer: AG, AT in komplement (prvi sistem), ovčji eritrociti in hemolitični serum (drugi sistem).

Antigen za CSC so lahko kulture različnih ubijenih mikroorganizmov, njihovih lizatov, sestavin bakterij, patološko spremenjenih in normalnih organov, tkivnih lipidov, virusov in materialov, ki vsebujejo viruse.

Svež ali suh serum morskih prašičkov se uporablja kot dopolnilo.

Mehanizem. RSK se izvaja v dveh fazah: 1. faza - inkubacija mešanice, ki vsebuje tri komponente antigen + protitelo + komplement; 2. faza (indikator) - odkrivanje prostega komplementa v mešanici z dodajanjem hemolitičnega sistema, sestavljenega iz ovčjih eritrocitov in hemolitičnega seruma, ki vsebuje protitelesa proti njim. V prvi fazi reakcije, ko nastane kompleks antigen-protitelo, ga komplement veže, nato pa v 2. fazi ne bo prišlo do hemolize eritrocitov, občutljivih na protitelesa; reakcija je pozitivna. Če se antigen in protitelo med seboj ne ujemata (v preskusnem vzorcu ni antigena ali protitelesa), ostane komplement prost in se v 2. fazi pridruži kompleksu protiteles eritrocit-anti-eritrocit, kar povzroči hemolizo; reakcija je negativna.

Uporaba. RSK se uporablja za diagnosticiranje številnih nalezljivih bolezni, zlasti sifilisa (Wassermanova reakcija).

Trdnofazna ELISA- varianta testa, ko se ena od komponent imunskega odziva (antigen ali protitelo) sorbira na trdnem nosilcu, na primer v vdolbinicah iz polistirenskih plošč. Sestavine odkrijemo z dodatkom označenih protiteles ali antigenov. Če je rezultat pozitiven, se barva kromogena spremeni. Vsakič po dodajanju naslednje komponente se nevezani reagenti odstranijo iz vdolbinic s spiranjem,

I. Pri določanju protiteles (leva slika) se v jamice plošč s sorbiranim antigenom zaporedno dodajo bolnikov krvni serum, antiglobulinski serum, označen z encimom, in substrat / kromogen za encim.

II. Pri določanju antigena (desna slika) se antigen vnese v vdolbinice z adsorbiranimi protitelesi (na primer krvni serum z želenim antigenom), diagnostični serum proti njemu in sekundarna protitelesa (proti diagnostičnemu serumu), označena z encimom, so in nato substrat / kromogen za encim.

Konkurenčna ELISA za določitev antigenov: ciljni antigen in encimsko označen antigen med seboj tekmujeta za vezavo omejenega števila protiteles imunskega seruma.

Drug test je Competitive ELISA za določanje protiteles: ciljna protitelesa in protitelesa, označena z encimi, med seboj tekmujejo za antigene, adsorbirane na trdni fazi.

Imunobloting- zelo občutljiva metoda za odkrivanje beljakovin, ki temelji na kombinaciji elektroforeze in ELISA ali RIA. Imunobloting se uporablja kot diagnostična metoda za okužbo s HIV itd.

Antigene patogenov ločimo z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu, nato jih prenesemo iz gela na aktivirano papirno ali nitrocelulozno membrano in razvijemo z uporabo ELISA. Podjetja proizvajajo takšne trakove z antigenom. Na te trakove se nanese pacientov serum. . Nato se po inkubaciji sperejo nevezana protitelesa bolnika in nanese serum proti človeškim imunoglobulinom, označenim z encimom . Kompleks, ki nastane na traku [antigen + pacientovo protitelo + protitelo proti človeškemu Ig], odkrijemo z dodajanjem kromogenega substrata, ki spremeni barvo pod delovanjem encima.