Esistono molti metodi per la determinazione qualitativa e quantitativa degli anticorpi virus-specifici. Utilizzando questi metodi, è possibile rilevare contemporaneamente sia IgM che IgG e separatamente le immunoglobuline di ciascuna classe. Di norma, nella reazione di legame del complemento vengono rilevate solo IgG virus-specifiche. Tuttavia, quando si testano gli antigeni microbiologici con questo metodo, è possibile determinare contemporaneamente IgM e IgG specifiche.

I metodi immunologici vengono utilizzati principalmente per due scopi: in primo luogo, per diagnosticare un'infezione virale in corso, completata o congenita e, in secondo luogo, per rilevare anticorpi specifici, la cui presenza indica un'infezione pregressa e, quindi, l'immunità a una possibile reinfezione. In termini di forza della risposta immunitaria a un'infezione virale, le persone sono molto diverse l'una dall'altra. Nella fig. 3 mostra una tipica curva di aumento del titolo

anticorpi in risposta all'infezione primaria da rosolia. È facile vedere che la diagnosi di rosolia è possibile aumentando il titolo di IgG specifiche e identificando IgM specifiche. La presenza di IgM specifiche nel sangue di un neonato indica un'infezione intrauterina, poiché le IgM materne, a differenza delle IgG, vengono trattenute dalla placenta. Le IgG specifiche dell'infezione primaria di solito persistono per tutta la vita. Pertanto, la presenza di anticorpi di questa classe nel siero del sangue indica l'immunità alla corrispondente reinfezione.

Di seguito sono riportati metodi immunologici per rilevare anticorpi specifici contro il virus della rosolia, che sono particolarmente efficaci per diagnosticare malattie fetali e determinare il titolo di anticorpi specifici nel siero del sangue. Descrizioni dettagliate i metodi utilizzati per diagnosticare la rosolia possono essere trovati nelle recensioni di Pattison e Morgan-Kapner.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione

Il virus della rosolia provoca l'emoagglutinazione dei globuli rossi in molte specie animali. Molto spesso, nell'RTGA vengono utilizzati eritrociti di polli di un giorno. In questa reazione, il virus cresciuto in coltura e trattato con Tween 80 ed etere funge da antigene emoagglutinante del virus della rosolia. Il pretrattamento aumenta il titolo di HA del virus.

5.1.1 Standardizzazione dell'antigene HA della rosolia

1. 1 ml di una sospensione al 50% di eritrociti di pollo viene lavato tre volte in tampone Veronal con destrano e gelatina mediante centrifugazione e risospensione del sedimento in una provetta da centrifuga graduata da 15 ml. Le cellule lavate vengono risospese in tampone DGV per ottenere una sospensione al 30%.

Tabella 3. Preparazione del tampone Veronal con destrano e gelatina

2. Diluire la preparazione liofilizzata dell'antigene HA del virus della rosolia nel volume di acqua distillata necessaria secondo le istruzioni.

3. Aggiungere 1 volume di DGV a ciascuno degli otto pozzetti di due file adiacenti di una micropiastra in polistirene a 96 pozzetti con pozzetti U per diversi.

4. Nei primi pozzetti di due file viene aggiunto un volume dell'antigene HA del virus della rosolia.

5. Diluizioni seriali doppie dell'antigene HA della rosolia, comprese tra 1: 2 e 1: 256, vengono preparate utilizzando un microtitolo da 0,025 ml. Prima dell'uso, la testa del microtitolatore deve essere calcinata in una fiamma rovente, quindi raffreddata per alcuni secondi, posta in acqua distillata e tamponata con carta da filtro.

6. Aggiungere un volume aggiuntivo di tampone DGV a ciascuno dei pozzetti riempiti. Come controllo si aggiungono due volumi di tampone DGV ai pozzetti 12 delle prime due file.

7. La sospensione di eritrociti lavati di polli viene diluita 100 volte con tampone DGV, ottenendo così una sospensione allo 0,03%.

8. In tutti i 18 pozzetti aggiungere due volumi di sospensione allo 0,03% di eritrociti, la piastra finita viene coperta con un'altra piastra non utilizzata e incubata per 1 ora a 4°C.

9. Sul fondo dei pozzetti di controllo si forma una densa "placca" di eritrociti non agglutinati. Gli eritrociti agglutinati si depositano uniformemente. Il titolo HA è considerato il reciproco della più alta diluizione dell'antigene HA del virus della rosolia, alla quale si verifica ancora l'agglutinazione completa. Questa diluizione contiene 1 unità emoagglutinante.

Per il test dei sieri vengono utilizzate 4 unità GA di antigene della rosolia. Pertanto, se il titolo dell'antigene GA è 32, per rilevare gli anticorpi contro il virus della rosolia, viene diluito con DGV otto volte. L'antigene diluito è stabile per 25-48 ore a 4°C.

5.1.2 Pretrattamento del siero

Tutti i sieri contengono inibitori dell'emoagglutinazione non specifici che devono essere rimossi. Gli inibitori GA non specifici sono principalmente lipoproteine, che vengono rilasciate trattando il siero con caolino. Inoltre, nel siero umano possono essere presenti agglutinine non specifiche degli eritrociti di pollo. Tuttavia, l'adsorbimento preliminare dei sieri testati da parte degli eritrociti non è necessario, poiché tutte le emoagglutinine aspecifiche presenti nei sieri si trovano nei controlli.

1. In provette di vetro numerate aggiungere 0,2 ml di siero. Oltre ai sieri studiati, in ogni esperimento sono richiesti controlli positivi e negativi.

2. Aggiungere 0,8 ml di caolino al 25% in tampone borato-salino a ciascuna provetta.

3. Il contenuto delle provette viene agitato e lasciato a temperatura ambiente per 20 minuti.

4. Il caolino esausto viene precipitato mediante centrifugazione in una centrifuga da tavolo a 2000 rpm per 20 minuti.

5. Trasferire il surnatante in provette pulite e numerate. Come risultato della purificazione, si ottiene il siero, diluito quattro volte. Sono usati per formulare una reazione di inibizione dell'emoagglutinazione. I sieri possono essere conservati a 4°C durante la notte.

5.1.3 Inibizione della reazione dell'emoagglutinazione

1. Per testare un campione di siero, aggiungere un volume di DGV a una fila di pozzetti.

2. Aggiungere un volume di siero diluito quattro volte nel primo e nell'ultimo pozzetto.

3. Utilizzando un microtitolo, preparare due diluizioni sequenziali del siero.

4. Un volume di antigene GA della rosolia contenente 4 GAU viene aggiunto ai pozzetti 1-10. L'antigene della rosolia GA non viene aggiunto al pozzetto 12.

5. Nei pozzetti 1-8 di un'altra piastra, viene aggiunto un volume della diluizione di lavoro dell'antigene HA della rosolia e quindi in otto pozzetti vengono preparate diluizioni doppie successive dell'antigene HA. A questi 16 pozzi viene aggiunto un volume di DGV. Questa titolazione è un test per l'antigene HA della rosolia. Per il controllo vengono aggiunti due volumi di DGV ai pozzetti 12 della prima e della seconda fila.

6. Le piastre coperte vengono lasciate per 1 ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.

7. In tutti i pozzetti riempiti, vengono aggiunti due volumi di sospensione allo 0,03% di eritrociti di pollo e le piastre vengono lasciate per 1 - 1,5 ore a 4 ° C.

8. Osservando le piastre, determinare il titolo dell'antigene HA della rosolia. Non deve verificarsi agglutinazione nei pozzetti di controllo.

9. Se gli eritrociti sierico agglutinati in assenza dell'antigene GA della rosolia, è necessario ripetere il test della diluizione iniziale del siero. Prima di ciò, il siero viene adsorbito con una goccia di una sospensione al 30% di eritrociti di pollo per 1 ora a temperatura ambiente, quindi gli eritrociti vengono precipitati mediante centrifugazione.

10. Il titolo di anticorpi specifici nel siero studiato è considerato il reciproco della diluizione, alla quale l'emoagglutinazione è completamente soppressa.

5.1.4 Interpretazione dei risultati

Con un titolo basso, è difficile interpretare i risultati, poiché con una piccola diluizione è possibile la presenza residua di inibitori aspecifici. La presenza di anticorpi virus-specifici è considerata provata a un titolo di 16 o superiore.

La reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA) è un metodo per identificare un virus o rilevare anticorpi antivirali nel siero del sangue del paziente, basato sul fenomeno dell'assenza di agglutinazione degli eritrociti da parte di un farmaco contenente un virus in presenza di siero immune ad esso.

Molti virus hanno la capacità di agglutinare gli eritrociti di specie rigorosamente definite di mammiferi e uccelli. Quindi, i virus dell'influenza e della parotite agglutinano gli eritrociti dei polli, porcellini d'India, umani e adenovirus - eritrociti di ratti e topi. A tal proposito, per la loro rilevazione nel materiale dei pazienti o in colture di cellule, embrioni e animali, viene impostata la reazione di emoagglutinazione (RHA). Per questo, nei pozzetti delle piastre vengono preparate diluizioni doppiamente crescenti di materiali e liquidi vaccinati, aggiungendo ad esse sospensioni eritrocitarie di NaCl lavate con una soluzione isotonica. Per controllare l'agglutinazione spontanea, gli eritrociti vengono miscelati con un volume uguale di soluzione isotonica di NaCl. Le miscele vengono incubate in un termostato a 37 ° C oa temperatura ambiente.

I risultati di RGA sono presi in considerazione dalla natura dell'agglutinazione degli eritrociti dopo 30-60 minuti, quando di solito sono completamente precipitati nel controllo. Le reazioni positive sono indicate da vantaggi. "++++" - sedimento sotto forma di "ombrello", "+++" - sedimento con spazi vuoti, "++" - sedimento con ampi spazi, "+" - sedimento flocculante circondato da una zona di eritrociti accartocciati e "-" - lo stesso sedimento nettamente delineato di eritrociti sotto forma di un "bottone", come nel controllo.

Essendo gruppo-specifico, l'RHA non consente di determinare le specie di appartenenza dei virus. Sono identificati utilizzando la reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI). Per la sua impostazione vengono utilizzati sieri immuni antivirali noti, che vengono diluiti in una soluzione isotonica di cloruro di sodio in concentrazioni due volte decrescenti e versati nei pozzetti. Una quantità uguale di liquido vaccinato viene aggiunta a ciascuna delle loro diluizioni. Il controllo è una sospensione del virus in soluzione isotonica di cloruro di sodio. Le piastre con una miscela di sieri e virus vengono mantenute in un termostato per 30 minuti oa temperatura ambiente per 2 ore, quindi a ciascuna di esse viene aggiunta una sospensione di eritrociti. Dopo 30 minuti, viene determinato il titolo del siero neutralizzante (cioè la sua massima diluizione), che ha causato un ritardo nell'agglutinazione degli eritrociti.

RTGA è utilizzato nella diagnostica sierologica delle malattie virali, in particolare le infezioni da influenza e adenovirus. È meglio metterlo allo stesso modo di PH, con sieri abbinati. Un aumento di quattro volte del titolo anticorpale nel secondo siero conferma la diagnosi presunta.

La reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA) si basa sul blocco, la soppressione degli antigeni virali da parte degli anticorpi del siero immunitario, a seguito della quale i virus perdono la capacità di agglutinare gli eritrociti.

RTGA viene utilizzato per diagnosticare molte malattie virali, i cui agenti causali (influenza, morbillo, rosolia, virus dell'encefalite trasmessa da zecche, ecc.) Possono agglutinare gli eritrociti di vari animali.

Meccanismo. La tipizzazione del virus viene effettuata nella reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA) con una serie di sieri tipo-specifici. I risultati della reazione vengono presi in considerazione in assenza di emoagglutinazione. I sottotipi di virus A con antigeni H 0 N 1, H 1 N 1, H 2 N 2, H 3 N 2, ecc. possono essere differenziati in RTGA con una serie di sieri omologhi tipo-specifici.

Recentemente, la reazione è stata ampiamente utilizzata nei laboratori di virologia clinica per determinare i titoli di anticorpi specifici contro determinati virus, nonché per l'identificazione sierologica e la tipizzazione di isolati di virus da materiale clinico di pazienti. Sono usati in qualche modo in modo limitato a causa della presenza nel siero del sangue di persone di inibitori non specifici dei virus, nonché di anticorpi naturali - agglutinine.

Principio RTGA consiste nel mescolare volumi uguali di siero sanguigno e sospensione virale in una provetta, e dopo l'esposizione si determina se il virus è conservato nella miscela aggiungendo una sospensione di eritrociti. L'agglutinazione degli eritrociti indica la presenza e l'assenza di emoagglutinazione indica l'assenza di un virus nella miscela. La scomparsa del virus dalla miscela virus + siero è considerata un segno dell'interazione tra anticorpi sierici e virus.

Ma gli anticorpi interagiscono con gli antigeni in rapporti quantitativi rigorosamente definiti. Pertanto, affinché una certa quantità di virus venga privata della capacità emoagglutinante, è necessario un certo minimo di anticorpi e poiché uno dei componenti di RTGA è sempre sconosciuto, è necessario mettere la reazione in una fila di provette con diverse dosi di anticorpi e le stesse dosi del virus, o viceversa. Ciò si ottiene assumendo diverse diluizioni del siero e la stessa diluizione del virus, oppure diverse diluizioni del virus e la stessa diluizione del siero.

RTGA consente di risolvere i seguenti compiti: determinare il titolo degli anticorpi contro il virus emoagglutinante nel siero; identificare un virus emoagglutinante sconosciuto da sieri noti; stabilire il grado di relazione antigenica di due virus.

Vantaggi dell'RTGA: semplicità di tecnologia, velocità, lavoro sterile non richiesto, specificità, basso costo. Svantaggio: RTGA è possibile solo con virus emoagglutinanti.

Principio di titolazione degli anticorpi in RTGAè come segue:

- preparare una serie di diluizioni sequenziali (normalmente 2 volte) del siero in esame in volumi uguali (normalmente 0,25 o 0,2 ml);

- ad ogni diluizione aggiungere gli stessi volumi di virus omologo in un titolo di 4 HAU;

- le miscele vengono mantenute per un certo tempo ad una certa temperatura (per il virus della malattia di Newcastle 40-60 minuti a temperatura ambiente);

- a tutte le miscele si aggiungono volumi uguali di una sospensione all'1% di eritrociti lavati;

- dopo l'esposizione, valutare l'emoagglutinazione in ogni miscela in croci.

La reazione include controlli per siero, virus ed eritrociti.

La più alta diluizione del siero, che inibisce ancora completamente l'emoagglutinazione, è considerata un indicatore del titolo anticorpale in questo siero.

Uso delle reazioni di emoassorbimento in virologia.

RGAD. L'emoassorbimento - la connessione degli eritrociti con la superficie delle cellule colpite dal virus - è stato scoperto per la prima volta da Vogel e Shchelokov (1957) su una coltura tissutale infettata dal virus dell'influenza. Questo fenomeno si basa sulla relazione dei recettori del virus situati sulla superficie della cellula interessata con i recettori degli eritrociti, che porta alla loro reciproca adesione simile alla reazione di emoagglutinazione. Il vantaggio di questa reazione è che diventa positiva anche prima della comparsa di distinti cambiamenti citopatici nelle cellule infette.

Metodologia RGADè come segue. Il 3-4 ° giorno dopo l'infezione delle cellule, prendi due provette con la stessa coltura di cellule, una delle quali è infettata con materiale vaccinato e la seconda è di controllo. Il liquido di coltura viene drenato da entrambe le provette e ad entrambe vengono aggiunte 2-3 gocce di una sospensione allo 0,5% di eritrociti lavati. Entrambi i tubi vengono lasciati per 5-10 minuti in modo che gli eritrociti siano sulla superficie delle cellule (posizionati orizzontalmente sul tavolo), quindi leggermente sciacquati con soluzione fisiologica ed esaminati al microscopio (basso ingrandimento). Nella provetta di controllo, i globuli rossi vengono completamente rimossi con soluzione salina e alcuni di quelli rimanenti galleggiano con il liquido. Se in una provetta infetta gli eritrociti non vengono rimossi con soluzione fisiologica e non galleggiano, ma sono attaccati alla superficie delle cellule, la RHAD deve essere considerata positiva.

A seconda del virus e del tipo di cellule, la posizione dei globuli rossi può essere triplice:

- gli eritrociti vengono adsorbiti solo lungo la periferia dello strato cellulare sotto forma di "collana" (virus della peste suina africana);

- gli eritrociti si trovano sullo strato cellulare in focolai o cluster (virus dell'influenza);

- gli eritrociti sono localizzati diffusamente sullo strato cellulare (virus parainfluenzale).

Ogni virus è in grado di assorbire i globuli rossi di alcuni tipi di animali.

Diagnosi sierologica delle malattie virali basata sull'aumento del titolo anticorpale in sieri di sangue appaiati.

Reazione di emoagglutinazione (RHA) e reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA), meccanismo, componenti e applicazione delle reazioni.

La reazione di emoagglutinazione si basa sul fenomeno dell'adesione degli eritrociti, che si verifica sotto l'influenza di vari fattori. Distinguere tra emoagglutinazione diretta e indiretta.

Innanzitutto, gli eritrociti vengono lavati con una soluzione isotonica di cloruro di sodio, quindi, se necessario (quando si utilizzano antigeni di natura proteica), vengono trattati con una soluzione di tannino 1: 20.000 e sensibilizzati con antigeni solubili. Dopo il lavaggio con una soluzione isotonica tamponata di cloruro di sodio, l'antigene eritrocitario è pronto per l'uso.

I sieri studiati vengono diluiti con soluzione isotonica di cloruro di sodio in provette o speciali piastre di plastica con pozzetti, quindi ad ogni diluizione di siero viene aggiunto l'eritrocito diagnostico. I risultati della reazione di emoagglutinazione indiretta sono presi in considerazione dalla natura del sedimento eritrocitario formato sul fondo della provetta. Il risultato della reazione è considerato positivo, in cui i globuli rossi coprono uniformemente l'intero fondo della provetta. In caso di reazione negativa, gli eritrociti sotto forma di un piccolo disco o "bottone" si trovano al centro del fondo della provetta

I componenti principali del PR:

A) antigene solubile,

B) Anticorpi specifici (siero)

(RTGA) è un metodo per identificare un virus o rilevare anticorpi antivirali nel siero del sangue del paziente, basato sul fenomeno dell'assenza di agglutinazione degli eritrociti da parte di un farmaco contenente un virus in presenza di siero ad esso immune.
basato sul blocco, soppressione degli antigeni dei virus da parte degli anticorpi del siero immunitario, a seguito della quale i virus perdono la capacità di agglutinare gli eritrociti.

RTGA viene utilizzato per diagnosticare molte malattie virali, i cui agenti causali (influenza, morbillo, rosolia, virus dell'encefalite trasmessa da zecche, ecc.) Possono agglutinare gli eritrociti di vari animali.
Meccanismo. La tipizzazione del virus viene effettuata nella reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA) con una serie di sieri tipo-specifici. I risultati della reazione vengono presi in considerazione in assenza di emoagglutinazione. Sottotipi di virus A con antigeni H0N1, H1N1, H2N2, H3N2, ecc.

possono essere differenziati in RTGA con un set di sieri omologhi tipo-specifici.

Al centro della reazioni di emoagglutinazione risiede il fenomeno dell'adesione degli eritrociti, che si verifica sotto l'influenza di vari fattori.

Distinguere tra emoagglutinazione diretta e indiretta.
Nella reazione di emoagglutinazione diretta, gli eritrociti si uniscono quando alcuni antigeni, come i virus, vengono adsorbiti su di essi.
Negli studi sierologici, viene utilizzata una reazione di inibizione dell'emoagglutinazione diretta, quando un virus isolato da un paziente viene neutralizzato con un siero immunitario specifico e quindi combinato con gli eritrociti.

L'assenza di emoagglutinazione indica la corrispondenza del virus e del siero immunitario utilizzato.

La reazione di emoagglutinazione indiretta (emoagglutinazione passiva) si osserva nei casi in cui agli eritrociti precedentemente trattati (sensibilizzati) con vari antigeni viene aggiunto il siero immunitario o il siero del paziente con i corrispondenti anticorpi.

Esiste un incollaggio specifico degli eritrociti, la loro emoagglutinazione passiva.

La reazione di emoagglutinazione indiretta o passiva in sensibilità e specificità è superiore ad altri metodi sierologici ed è utilizzata nella diagnosi di infezioni causate da batteri, rickettsie, protozoi.

La tecnica di messa in scena della reazione di emoagglutinazione indiretta consiste in diverse fasi.

Innanzitutto, gli eritrociti vengono lavati con una soluzione isotonica di cloruro di sodio, quindi, se necessario (quando si utilizzano antigeni di natura proteica), vengono trattati con una soluzione di tannino 1: 20.000 e sensibilizzati con antigeni solubili.

Dopo il lavaggio con una soluzione isotonica tamponata di cloruro di sodio, l'antigene eritrocitario è pronto per l'uso. I sieri studiati vengono diluiti con soluzione isotonica di cloruro di sodio in provette o speciali piastre di plastica con pozzetti, quindi ad ogni diluizione di siero viene aggiunto l'eritrocito diagnostico.

I risultati della reazione di emoagglutinazione indiretta sono presi in considerazione dalla natura del sedimento eritrocitario formato sul fondo della provetta. Il risultato della reazione è considerato positivo, in cui i globuli rossi coprono uniformemente l'intero fondo della provetta. Se la reazione è negativa, i globuli rossi sotto forma di un piccolo disco o "bottone" si trovano al centro del fondo della provetta.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione- una reazione sierologica basata sulla capacità degli anticorpi di prevenire l'agglutinazione degli eritrociti da parte dei virus emoagglutinanti (adenovirus, arbovirus, alcuni enterovirus, virus influenzali e parainfluenzali, morbillo, reovirus).

Specifici anticorpi antivirali interagiscono con le molecole di emoagglutinina di superficie dei virioni di questi virus e ne bloccano il legame con molecole complementari di membrana degli eritrociti.

Recentemente, la reazione è stata ampiamente utilizzata nei laboratori di virologia clinica per determinare i titoli di anticorpi specifici contro determinati virus, nonché per l'identificazione sierologica e la tipizzazione di isolati di virus da materiale clinico di pazienti.

Sono usati in qualche modo in modo limitato a causa della presenza nel siero del sangue di persone di inibitori non specifici dei virus, nonché di anticorpi naturali - agglutinine.

La reazione di neutralizzazione è una reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA).

RTGA si applica:
-per la sierotipizzazione dei virus;
- per la sierodiagnosi delle infezioni.
Esistono due modalità di messa in scena:
- metodo a goccia su vetro (reazione approssimata), utilizzato per la copiatura grigia dei virus;
- spiegato in provette.

Meccanismo.

Alcuni virus (ad esempio l'influenza) hanno emoagglutinina, che provoca l'agglutinazione dei globuli rossi in diversi animali, a seconda del tipo di virus.

In presenza di anticorpi nel siero - antiemoagglutinine, si osserva l'inibizione dell'attività dei virus.
RTGA.
Obiettivo: sierotipizzazione del virus dell'influenza A

Componenti:
1. Materiale di prova: fluido allantoico di un embrione di pollo,
2. Siero anti-influenzale diagnostico specifico per tipo,
Sospensione al 3,5% di eritrociti di pollo.
4.

salina.

La reazione viene posta sul vetro con il metodo a goccia. Applicare 1 goccia di sieri diagnostici e materiale di prova sul vetro, mescolare, quindi aggiungere 1 goccia di sospensione di eritrociti. Con una reazione positiva si osserva un arrossamento omogeneo e con una reazione negativa cadono scaglie rosse (emoagglutinazione).

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Caratterizzazione dei virus influenzali. Epidemiologia e diagnosi dell'influenza. Uso di RTGA per la sierotipizzazione dei virus influenzali. Preparati per la profilassi e il trattamento specifici.

Influenza o influenza - acuta infezione caratterizzato da danni alle mucose della tomaia vie respiratorie, febbre, intossicazione generale, ridotta attività del sistema cardiovascolare e nervoso.

L'influenza è caratterizzata da una tendenza alla diffusione epidemica e pandemica a causa dell'elevata contagiosità e variabilità del patogeno.

Caratteristiche dei patogeni. Gli agenti patogeni - i virus dell'influenza appartengono a questo. Orthomyxoviridae, i generi Influenzavirus A, B e Influenzavirus C. I virus dell'influenza sono virus a RNA. Il virus dell'influenza di tipo A è stato isolato nel 1933 da W. Smith, K. Andrews, P. Laidlaw. Nel 1940 T.

Applicazione del metodo dell'emoagglutinazione in virologia.

Francis e R. Medgill isolarono i virus dell'influenza di tipo B, nel 1949 R. Taylor - tipo C. In Russia, i primi virus dell'influenza furono isolati nel 1936 da A. A. Smorodintsev e classificati come tipo A. Morfologia. I virus dell'influenza hanno una forma sferica (a forma di palla) - 80 - 120 nm, meno spesso hanno una forma filamentosa. Sono costituiti da: 1) un nucleo - un nucleocapside di un tipo di simmetria a spirale (stringa lineare "-" a singolo filamento di RNA + capside proteico); 2) membrana basale - membrana lipoproteica esterna - supercapside.

Sulla superficie della membrana sono presenti 2 tipi di glicoproteine ​​(sotto forma di spine e villi): 1) emoagglutinina - favorisce l'attaccamento ai recettori cellulari; 2) neuraminidasi - promuove il rilascio del virus dalla cellula. Coltivazione. Per la coltivazione vengono utilizzati embrioni di pollo, colture cellulari tripsinizzate primarie e talvolta animali da laboratorio.

Il modello più conveniente sono gli embrioni di pollo di 10-12 giorni di età. Consente di ottenere grandi quantità del virus, necessario nella produzione di vaccini e preparati batterici.

L'infezione viene effettuata nella cavità allontoica, nella membrana corion-allontoica, nella cavità amniotica, nell'amnios. La presenza del virus nell'embrione di pollo viene rilevata nella reazione di emoagglutinazione. Struttura antigenica. I virus hanno un antigene interno - S e antigeni di superficie: HA-emoagglutinina e NA-neuraminidasi. L'antigene S è specifico del gruppo, comune per l'intero tipo, poiché questo antigene i virus dell'influenza sono divisi nei tipi A, B e C. È un antigene che si lega al complemento, stabile (immutabile).

Gli antigeni HA e NA sono antigeni specifici. L'antigene HA provoca la formazione di anticorpi neutralizzanti il ​​virus e l'adesione degli eritrociti.

L'antigene NA provoca la formazione di anticorpi che neutralizzano parzialmente i virus.

Il virus di tipo B è meno variabile e il tipo C è altamente stabile.

Proprietà tossiche. L'effetto tossico del virus sul corpo ( male alla testa, dolore muscolare, temperatura, fenomeni catarrali) è causato dalle proteine ​​del virus (la particella più virale). Questa azione è strettamente specifica e viene neutralizzata solo dal siero immunitario del tipo o sottotipo corrispondente o dal siero di chi è stato malato. Resistenza. I virus dell'influenza sono sensibili ai raggi UV, ai disinfettanti (formalina, alcool, fenolo, clorammine) e ai solventi grassi.

In un mezzo liquido, muoiono a una temperatura di 50 - 60 ° C in pochi minuti. A temperatura ambiente nell'aria, i virus rimangono infettivi per diverse ore. Sono conservati a lungo in una forma essiccata e allo stato congelato (-70 ° C) non solo persistono a lungo, ma non perdono la virulenza.

La suscettibilità degli animali. In condizioni naturali, i virus di tipo A infettano l'uomo e gli animali (cavalli, maiali si ammalano) e i virus di tipo B e C - solo gli umani. Tra gli animali da laboratorio, i topi bianchi, i furetti africani, i criceti siriani e le scimmie sono suscettibili ai virus.

La malattia negli animali è caratterizzata da danno polmonare, stato febbrile e può provocare la morte degli animali. Epidemiologia della malattia. La fonte dell'infezione è una persona malata con una forma clinicamente espressa o asintomatica. Una persona malata rilascia il virus nell'ambiente quando tossisce, parla, starnutisce con gocce di saliva, muco, espettorato già durante il periodo di incubazione.

Il paziente diventa contagioso 24 ore prima dell'insorgenza dei sintomi principali e presenta un pericolo epidemico entro 48 ore dalla loro scomparsa.

Il meccanismo di trasmissione è aerogeno. La via di trasmissione è aerea. Le persone sono molto sensibili all'influenza. Tutti i gruppi di età sono malati, soprattutto in inverno. I più sensibili sono i bambini e gli anziani. Il nome della malattia riflette le caratteristiche dell'epidemiologia: influenza dal francese. pinza - afferrare, influenza - dall'italiano. Influenza di freddo - l'influenza del freddo.

Di tutti i taglienti problemi respiratori l'influenza è la malattia più diffusa e grave. Le pandemie e le epidemie influenzali coprono fino al 30-50% o più della popolazione mondiale, causando enormi danni alla salute e all'economia dei paesi. Le prime descrizioni di epidemie influenzali risalgono al XII-XIV secolo. L'emergere di pandemie e grandi epidemie è causato dal virus dell'influenza di tipo A, che è dovuto all'elevata variabilità del virus ed è associato all'emergere di un nuovo sottotipo a seguito dello spostamento dell'antigene.

Tra le pandemie, si verificano epidemie ogni 1,5-2 anni, che è associata alla deriva antigenica dei virus. Nel 1918, la pandemia di influenza spagnola (1,5 miliardi di persone si ammalarono, 20 milioni morirono) fu causata dal virus dell'influenza A1. Registrata principalmente in Spagna, questa pandemia copriva quasi l'intera popolazione della Terra; la malattia era caratterizzata dallo sviluppo di polmonite emorragica estremamente grave con un tasso di mortalità record (fino all'1% di tutti i casi).

Nel 1957, la pandemia "asiatica" (2 miliardi di persone si ammalarono) fu causata da un nuovo sottotipo - sottotipo A2. Nel 1968, la pandemia di "Hong Kong" (1 miliardo di persone si ammalò) fu causata da un sottotipo appena emerso - sottotipo A3. Di norma, una nuova variante del virus sostituisce una precedente varietà circolante nella popolazione umana.

Ma nel 1977, dopo una pausa di 20 anni, il tipo A1 è improvvisamente "tornato", portando a una grave epidemia. Di conseguenza, le varianti spostate del virus dell'influenza persistono ea determinati intervalli possono causare nuovamente un'epidemia. Il virus di tipo B provoca epidemie locali e il tipo C non causa epidemie. Patogenesi e quadro clinico della malattia. Il cancello d'ingresso è la via aerea superiore. Il virus invade le cellule epiteliali della mucosa e si moltiplica in esse.

L'effetto del virus sulle cellule epiteliali provoca la loro necrosi e desquamazione (rigetto) dell'epitelio, a seguito della quale la mucosa diventa permeabile a virus e batteri. Entrano nel flusso sanguigno e si diffondono in tutto il corpo. ”La viremia è accompagnata da lesioni multiple dell'endotelio capillare con un aumento della loro permeabilità.

Nei casi più gravi, ci sono estese emorragie nei polmoni, nel miocardio, negli organi parenchimali. I prodotti di decadimento delle cellule danneggiate e delle proteine ​​virali hanno un effetto tossico su vari organi e sistemi di organi. Le tossine del virus inibiscono fortemente il sistema nervoso centrale e, sebbene il processo non duri a lungo (3 - 5 giorni), la persona malata rimane indebolita a lungo e qualche infezione secondaria si unisce al corpo indebolito e sorgono complicazioni: l'influenza polmonite, edema polmonare acuto, danno renale, cuore, bronchi.

Una complicanza comune dell'influenza è la polmonite batterica (streptococchi di gruppo B). Durante la pandemia di influenza spagnola, le persone sono morte principalmente per polmonite batterica secondaria.

Nella patogenesi dell'influenza, non è importante solo l'intossicazione, ma anche l'allergia, nonché una violazione delle proprietà funzionali delle cellule immunitarie con lo sviluppo dell'immunodeficienza. Periodo di incubazione- diverse ore - 1-3 giorni. Caratterizzato da un esordio acuto, un aumento della temperatura a 37,5 - 38 ° C, intossicazione generale, espressa in malessere, mal di testa, dolore in bulbi oculari, processi infiammatori delle vie respiratorie di varia gravità (riniti, laringiti, tracheiti, faringiti).

La febbre con influenza senza complicazioni dura 5-6 giorni. Immunità. Dopo la malattia trasferita, si forma l'immunità tipo-specifica e ceppo-specifica, che è fornita da fattori cellulari e umorali specifici e non specifici. Gli anticorpi Ig A sono di grande importanza.L'immunità crociata non si sviluppa, dopo aver trasferito l'influenza di tipo A1, puoi ammalarti di influenza di tipo A2, ecc. Dopo il virus di tipo, l'immunità è di 1-2 anni, dopo il virus di tipo B - 3 - 5 anni.

Immunità naturale passiva - nei bambini sotto gli 8 - 11 mesi. A causa dell'elevata variabilità antigenica del virus, il recupero non porta allo sviluppo di una resistenza persistente alle infezioni ripetute.

Diagnostica di laboratorio. Materiale di prova: strisci-impronte dalla mucosa della cavità nasale, secrezione del rinofaringe, pezzi di polmoni, cervello in caso di morte.

Metodi diagnostici: 1) metodo di citorinoscopia - rilevamento di inclusioni intracellulari specifiche del virus - quando colorate con piottanina al microscopio, sono visibili inclusioni rosso vivo del virus dell'influenza nelle cellule dell'epitelio ciliare; 2) metodo virologico - l'isolamento del virus dell'influenza dal corpo umano infettando embrioni di pollo mediante lavaggio dal rinofaringe del paziente; l'indicazione (presenza) del virus viene effettuata con l'aiuto di RHA (virus influenzali agglutinano eritrociti umani e vari animali), l'identificazione del virus viene effettuata per fasi: il tipo è determinato nell'RSC, il sottotipo dell'emoagglutinina - nell'RTGA, e nel sottotipo neuraminidasi - nella reazione di inibizione dell'attività enzimatica; 3) metodo sierologico - rilevamento di un aumento del titolo (4 volte) di anticorpi specifici nel siero del sangue del paziente utilizzando RSK, RTGA, RN in coltura cellulare, reazione di precipitazione in un gel, ELISA; 4) metodo biologico - infezione intranasale di topi - l'introduzione di materiale nei polmoni sotto anestesia con etere; i topi muoiono dopo 2 o 3 giorni a causa della polmonite; 5) diagnostica espressa - rilevamento dell'antigene virale mediante RIF.

Trattamento e prevenzione.

Per la prevenzione e il trattamento nei primi giorni della malattia, viene utilizzato l'interferone leucocitario umano (per via intranasale). V scopi medicinali utilizzo farmaci antivirali- remantadina (influenza di tipo A), adapromina, virazolo e farmaci immunomodulatori - dibazolo, prodigiosan, levomizolo.

Nell'influenza grave, specialmente nei bambini, viene utilizzata l'immunoglobulina antinfluenzale del donatore, nonché farmaci - inibitori delle proteasi cellulari (gordox, contrikal, acido aminocaproico).

Profilassi speciale. Vengono utilizzati i seguenti farmaci antivirali e immunomodulatori, nonché vaccini - vivi e inattivati: 1) monovaccini vivi per somministrazione orale - ceppi attenuati di virus attualmente circolanti (A1, A3 e B); mostrano la massima immunogenicità; 2) vaccini a virione intero da ceppi virulenti inattivati ​​da formaldeide o raggi UV; 3) vaccini influenzali subunità solo da antigeni di superficie - antigeni HA e NA (hanno una reattogenicità minima).

Per ottenere i vaccini, i virus vengono coltivati ​​negli embrioni di pollo e in una coltura cellulare di embrioni di pollo.

Con l'introduzione dei vaccini si forma l'immunità locale e umorale. La vaccinazione viene effettuata durante i periodi di maggior rischio di epidemie. È principalmente indicato per giovani e anziani. L'uso di vaccini uccisi richiede una rivaccinazione annuale; la loro efficienza non supera il 60 - 70%.

Perché Poiché si osservano spesso variazioni antigeniche del patogeno, l'insieme di antigeni del virus corrispondente per l'immunizzazione può essere determinato solo dopo l'inizio dell'epidemia.

Biglietto 15.

Reazione di emoagglutinazione (RHA).

In laboratorio, usano due reazioni di emoagglutinazione che sono diverse nel meccanismo d'azione.

Il primo RHA è sierologico. In questa reazione, i globuli rossi si agglutinano quando interagiscono con gli anticorpi corrispondenti (emoagglutinine).

La reazione è ampiamente utilizzata per determinare i gruppi sanguigni.

La seconda RHA non è sierologica. In esso, l'adesione degli eritrociti non è causata

anticorpi e sostanze speciali formate da virus. Ad esempio, il virus dell'influenza agglutina gli eritrociti di polli e cavie, il virus della poliomielite - gli eritrociti di pecora. Questa reazione consente di giudicare la presenza di un particolare virus nel materiale di prova.

La reazione viene condotta in provette o su speciali piastre forate.

Il materiale da testare per la presenza del virus viene diluito con una soluzione isotonica da 1:10 a 1:1280; 0,5 ml di ciascuna diluizione vengono miscelati con un uguale volume di sospensione di eritrociti all'1-2%. Nel controllo, 0,5 ml di eritrociti vengono miscelati con 0,5 ml di soluzione isotonica. Le provette vengono poste in un termostato per 30 minuti e le piastre vengono lasciate a temperatura ambiente per 45 minuti.

Contabilità dei risultati. In risultato positivo reazione sul fondo della provetta o del pozzetto, cade un precipitato di eritrociti con bordi smerlati ("ombrello"), coprendo l'intero fondo del pozzetto.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione

Se il risultato è negativo, gli eritrociti formano un sedimento denso con bordi lisci ("bottone"). Lo stesso sedimento dovrebbe essere sotto controllo.

L'intensità della reazione è espressa dai segni "+". Il titolo del virus è la diluizione massima del materiale in cui avviene l'agglutinazione.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione

Questa è una reazione sierologica in cui anticorpi antivirali specifici, interagendo con un virus (antigene), lo neutralizzano e lo privano della capacità di agglutinare gli eritrociti, ad es.

Cioè, inibiscono la reazione di emoagglutinazione. Questa reazione consente di determinare il tipo e il tipo di virus.

Dichiarazione della reazione. 0,25 ml di siero antivirale vengono miscelati con un uguale volume di materiale contenente il virus. La miscela viene agitata e posta in termostato per 30 minuti, dopo di che si aggiungono 0,5 ml'1-2% di sospensione di eritrociti.

Contabilità dei risultati. Con la corretta impostazione dell'esperimento nel controllo del siero e degli eritrociti, dovrebbe essere formato un "pulsante" - non vi è alcun fattore che agglutina gli eritrociti; nel controllo dell'antigene si forma un "ombrello": il virus ha causato l'agglutinazione degli eritrociti.

Se il siero è omologo al virus studiato, si forma un "pulsante": il siero ha neutralizzato il virus.

Reazione di emoagglutinazione indiretta

La reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva) (RIGA) si basa sul fatto che gli eritrociti, se un antigene solubile viene adsorbito sulla loro superficie, acquisiscono la capacità di agglutinare quando interagiscono con gli anticorpi contro l'antigene adsorbito.

Dichiarazione della reazione.

Il siero viene riscaldato per 30 minuti a 56°C, diluito sequenzialmente in un rapporto di 1:10 - 1: 1280 e versato in provette o pozzetti da 0,25 ml, dove vengono poi aggiunte 2 gocce di eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi.

Controlli: una sospensione di eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi con siero ovviamente immune, una sospensione di eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi con siero normale; sospensione di eritrociti normali con il siero testato.

Nel primo controllo dovrebbe verificarsi l'agglutinazione, nel secondo e nel terzo no.

Domande di controllo.

1. Cosa indica un risultato RHA positivo tra eritrociti e materiale testato per la presenza del virus?

2. Si verificherà la reazione di agglutinazione degli eritrociti se ad essi si aggiunge il virus e il corrispondente siero?

Come si chiama la reazione che rivela questo fenomeno?

LAVORO PRATICO N. 12.

Reazione di legame del complemento.

La reazione di legame del complimento (CSC) si basa sul fatto che uno specifico complesso antigene-anticorpo adsorbe (lega) sempre il complemento su se stesso.

Questa reazione è ampiamente utilizzata nell'identificazione di antigeni e nella sierodiagnosi di infezioni, in particolare malattie causate da spirochete (reazione di Wasserman), rickettsie e virus.

Reazione sierologica del complesso RCC.

Coinvolge il complemento e due sistemi antigene-anticorpo. Essenzialmente, queste sono due reazioni sierologiche.

Il sistema giusto - quello principale - è costituito da un antigene e un anticorpo (uno è noto, l'altro no). Ad esso viene aggiunta una certa quantità di complemento. Quando l'antigene e gli anticorpi di questo sistema corrispondono, si uniranno e legheranno il complimento. Il complesso risultante è finemente disperso e non visibile.

La formazione di questo complesso è riconosciuta con l'aiuto di un secondo sistema emolitico o indicatore.

Comprende gli eritrociti di pecora (antigene) e il corrispondente siero emolitico (anticorpo), ad es. complesso immunitario già pronto. In questo sistema, la lisi dei globuli rossi può avvenire solo in presenza di complemento. Se il complemento è vincolato dal primo sistema, allora non ci sarà emolisi nel secondo sistema;

nessun complemento libero. L'assenza di emolisi (il contenuto della provetta è torbido o sul fondo del suo sedimento di eritrociti) viene registrata come risultato CSC positivo.

Se nel primo sistema l'antigene non corrisponde all'anticorpo, allora il complesso immunitario non si forma e il complimento rimarrà libero. Rimanendo libero, il complimento partecipa al secondo sistema, provocando l'emolisi, il risultato del CSC è negativo (il contenuto dei tubi è trasparente "lacca sangue").

Componenti, reazioni di legame del complemento:

Antigene - di solito lisato, estratto, aptene,

meno spesso una sospensione di microrganismi.

2. Anticorpo - siero del paziente.

3. Complemento - siero di cavia.

Antigene - eritrociti di pecora.

5. Anticorpo - emolisina agli eritrociti di pecora.

6. Soluzione isotonica.

A causa del fatto che un gran numero di componenti complessi è coinvolto in DGC,

devono essere pre-titolati e portati nella reazione in quantità esatte e in volumi uguali: 0,5 o 0,25 ciascuno, meno spesso 0,2.1.25 o 1,0 ml (volumi grandi danno un risultato più accurato). La titolazione dei componenti della reazione viene eseguita nello stesso volume dell'esperimento, sostituendo gli ingredienti mancanti con una soluzione isotonica.

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Si basa sul fatto che gli eritrociti, sui quali sono stati precedentemente adsorbiti gli antigeni, acquisiscono la capacità di agglutinare in presenza di sieri omologhi (anticorpi).

In questo caso, gli eritrociti agiscono come portatori con determinanti specifici, la cui agglutinazione avviene a seguito della reazione antigene + anticorpo.

Gli eritrociti, alla cui superficie sono saldamente attaccati gli antigeni, sono chiamati eritrociti antigenici diagnosticum o eritrociti sensibilizzati con un antigene.

Un altro tipo di RNGA: gli anticorpi vengono adsorbiti sulla superficie degli eritrociti e la loro successiva agglutinazione avviene in presenza di un antigene omologo.

In questo caso, tali eritrociti sono chiamati erythrocyte antibody diagnosticum o eritrociti sensibilizzati con anticorpi.

Sulla base di questi due fondamentali approcci metodologici, sono state sviluppate e vengono utilizzate molte modifiche dell'RNGA. Pertanto, piccole particelle di lattice standard vengono utilizzate come vettori.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA)

In questo caso, la reazione è chiamata reazione di agglutinazione al lattice (RLA) o viene utilizzata Staphylococcus aureus - la reazione di coagglutinazione, ecc. Di solito, la diagnostica degli eritrociti viene preparata presso le imprese dell'industria biologica e nei laboratori diagnostici hanno già messo il principale esperienza di RNGA.

La preparazione della diagnostica degli eritrociti comprende i seguenti passaggi:

• fissazione degli eritrociti con formaldeide o glutarale o aldeidi acriliche.

  Tali eritrociti elaborati persistono a lungo. Molto spesso, per questo scopo vengono utilizzati eritrociti di montone, umani, polli, ecc.;

• trattamento di eritrociti fissati con soluzione di tannino. Di conseguenza, gli eritrociti acquisiscono la proprietà di adsorbire irreversibilmente proteine ​​(virus e anticorpi) sulla loro superficie;
• sensibilizzazione di eritrociti abbronzati con virus o anticorpi.

Va notato che i metodi per preparare la diagnostica degli eritrociti per le infezioni virali sono diversi.

La tecnica per impostare l'RNGA per il rilevamento e la determinazione del titolo anticorpale è la seguente:

• dosi uguali di eritrociti sensibilizzati all'antigene vengono aggiunte a diluizioni seriali di 2 volte del siero;
• la miscela viene lasciata per 2-3 ore a temperatura ambiente o per 16-18 ore a 4°C;
• prendere in considerazione i risultati.

  Se il siero contiene anticorpi contro il virus, che ha sensibilizzato gli eritrociti, si osserva emoagglutinazione, che viene valutata in croci.

Per il titolo degli anticorpi nel siero, viene presa la più alta diluizione del siero, che fornisce ancora emoagglutinazione di almeno due croci.

RNGA è accompagnato da tutti i controlli pertinenti. Di solito, la reazione viene condotta con il micrometodo.

RNGA consente di risolvere le seguenti attività diagnostiche:

• rilevare gli anticorpi e determinarne il titolo nel siero del sangue utilizzando un diagnostico antigenico eritrocitario noto;
• rilevare e identificare un virus sconosciuto utilizzando un diagnostico anticorpale noto per gli eritrociti.

Vantaggi di RNGA: alta sensibilità, semplicità di tecnica di impostazione e risposta rapida.

Tuttavia, è importante notare che ci sono grandi difficoltà nella preparazione di una diagnostica eritrocitaria stabile (grande dipendenza dalla purezza dei componenti utilizzati, necessità di selezionare una modalità di fissazione, tanizzazione e sensibilizzazione degli eritrociti per ciascun tipo di virus).

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Utilizza eritrociti o materiali sintetici neutri (ad esempio particelle di lattice), sulla cui superficie vengono assorbiti antigeni (batterici, virali, tissutali) o anticorpi.

La loro agglutinazione si verifica quando vengono aggiunti i sieri o gli antigeni appropriati. Gli eritrociti sensibilizzati con antigeni sono chiamati diagnostici antigenici degli eritrociti e vengono utilizzati per rilevare e titolare gli anticorpi. Eritrociti sensibilizzati agli anticorpi. sono chiamati immunoglobuline eritrociti diagnostici e sono usati per rilevare gli antigeni.

La reazione di emoagglutinazione passiva viene utilizzata per diagnosticare malattie causate da batteri (febbre tifoide e paratifo, dissenteria, brucellosi, peste, colera, ecc.), protozoi (malaria) e virus (influenza, infezioni da adenovirus, Epatite virale B, morbillo, encefalite da zecche, febbre emorragica di Crimea, ecc.), nonché per determinare alcuni ormoni, per identificare l'ipersensibilità del paziente a farmaci e ormoni, come la penicillina e l'insulina.

Reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA).

La reazione di emoagglutinazione passiva è un metodo sensibile di diagnosi sierologica e viene utilizzata sia per la diagnostica precoce che retrospettiva, nonché per determinare lo stato immunopogico del vaccinato. Nei pazienti con tularemia, gli anticorpi vengono solitamente rilevati alla fine della 1a o 2a settimana della malattia, dopo 1-1,5 mesi i titoli RPHA raggiungono i valori massimi (1: 100000-1: 20.000, meno spesso superiori), dopo che diminuiscono al livello 1: 100-1: 200 vengono memorizzati per lungo tempo.

Nei vaccinati, gli anticorpi vengono anche costantemente rilevati, tuttavia, a titoli inferiori, non superiori a 1: 2000-1: 5000 1-1,5 mesi dopo la vaccinazione, rimangono per diversi anni a un livello basso di 1: 20-1: 80.

Tularemia erythrocyte diagnosticum (antigenico) funge da antigene per RPHA.

Il farmaco è un eritrociti di pecora formalinizzati sensibilizzati con l'antigene della tularemia, prodotti in forma liquida e secca. Preparazione liquida - una sospensione al 10% di eritrociti in una soluzione di formalina al 10% di concentrazione. Preparazione liofilizzata secca - sospensione al 10% di eritrociti essiccati sotto vuoto senza conservanti. Prima dell'uso, viene diluito secondo le indicazioni sull'etichetta. Per impostare la reazione in piastre di polistirene, entrambi i farmaci vengono utilizzati con una concentrazione del 2,5% e quando si imposta la reazione in microvolumi, con una concentrazione dello 0,5%.

Tecnica per mettere in scena RPGA.

I sieri testati vengono diluiti con soluzione fisiologica 1:5 (1:10) e riscaldati a 56°C per 30 minuti.

Reazione di emoagglutinazione (RHA) e

Successivamente, per rimuovere gli anticorpi eterogenei agli eritrociti di agnello, i sieri vengono trattati con una sospensione al 50% di eritrociti di agnello formalizzati. Per questo, gli eritrociti vengono aggiunti alla velocità di 2 gocce (0,05 ml ciascuno) per 1 ml di siero e miscelati accuratamente agitando.

Il siero viene lasciato fino a completa sedimentazione degli eritrociti, oppure centrifugato dopo un'ora a temperatura ambiente, dopodiché è pronto per la ricerca.

Il liquido diluente viene versato in un volume di 0,5 ml in una fila di fori di una lastra di polistirene.

In uno studio preliminare dei sieri, si consiglia di testarli impostando la reazione in una breve fila della piastra (6 pozzetti). Se gli anticorpi vengono rilevati in una fila corta, i sieri vengono ritestati in una fila di diluizione lunga (12 pozzetti).

Dopo aver versato il liquido diluente, aggiungere 0,5 ml dei sieri testati alla diluizione 1:5 nel primo pozzetto di ogni fila (corto o lungo). Quindi, negli stessi volumi di siero, titolare con diluizioni doppie. Si ottengono così diluizioni di siero nelle serie corte da 1:10 a 1:320 e nelle serie lunghe da 1:10 a 1:20480. Dopo la titolazione dei sieri, a ciascun pozzetto viene aggiunta una goccia (0,05 ml) di una sospensione funzionante al 2,5% di eritrociti sensibilizzati.

Il contenuto delle piastre viene agitato accuratamente fino ad ottenere una sospensione omogenea. Le piastre vengono lasciate a temperatura ambiente su una superficie fissa del tavolo. Una registrazione preliminare della reazione viene eseguita dopo 2-3 ore, la determinazione finale del titolo viene eseguita dopo la completa sedimentazione degli eritrociti nei pozzetti. Per la reazione sono previsti i seguenti controlli: 1) il siero in esame alla diluizione 1:10 in un volume di 0,5 ml + 1 goccia di una sospensione al 2,5% di eritrociti non sensibilizzati; 2) liquido di diluizione in un volume di 0,5 ml + 1 goccia di sospensione al 2,5% di eritrociti non sensibilizzati; 3) liquido di diluizione in un volume di 0,5 ml + 1 goccia di sospensione al 2,5% di eritrociti sensibilizzati.

Tutti i controlli dovrebbero essere chiaramente negativi.

Contabilità e valutazione di RPGA. La reazione viene valutata secondo il seguente schema:

1) una reazione nettamente positiva (++++) - gli eritrociti cadono sul fondo del foro in uno strato uniforme a forma di "ombrello", che spesso ha bordi smerlati;

2) reazione positiva (+++) - gli eritrociti coprono almeno 2/3 del fondo del pozzo;

3) una reazione debolmente positiva (++) - l'agglutinato è piccolo e si trova proprio al centro del foro;

4) una reazione dubbia (+) - ci sono grani separati di agglutinato attorno al sedimento eritrocitario proprio al centro del foro;

5) negativo (-) - nella parte inferiore del foro, gli eritrociti si depositano sotto forma di un "bottone" o di un piccolo anello con bordi lisci e ben definiti.

Il titolo del siero viene preso in considerazione in base all'ultima diluizione del siero, che ha dato una reazione abbastanza chiara (almeno tre plus).

Una diluizione di 1:100 e superiore è considerata un titolo diagnostico, tuttavia, come nel caso dell'AR, è necessario monitorarne l'aumento.

L'RPHA nella tularemia è abbastanza specifico e mostra alcune reazioni crociate solo con sieri di brucellosi. Diagnosi differenziale possibile dall'altezza dei titoli in RPHA, che sono significativamente più alti con un antigene omologo.

Tecnica per impostare RPGA in microvolumi.

L'RPGA può essere eseguito in microvolumi utilizzando una microtitolazione di tipo Takachi (o piastre per microtitolazione a fondo tondo con micropipette), che consente la titolazione del materiale in volumi di 25 μl e 50 μl. La tecnica di impostazione delle reazioni, la sequenza di tutte le operazioni è la stessa dello studio sulle lastre di polistirene. Tuttavia, va tenuto presente che la sensibilità del micrometodo è solitamente una diluizione (cioè

2 volte) inferiore al metodo macro.

Per impostare la reazione in un microtitolo, a ciascun pozzetto viene aggiunto un liquido di diluizione in un volume di 50 μl utilizzando una pipetta contagocce. Quindi, utilizzando titolatori con testina da 50 µl, si preleva il siero in esame immergendovi la testina.

Assicurarsi che il liquido abbia riempito la testa del titolatore. Trasferire il titolatore con siero nel primo pozzetto e, tenendolo in posizione verticale, eseguire diversi movimenti rotatori in entrambe le direzioni. Quindi il titolatore viene trasferito nel pozzetto successivo e la manipolazione viene ripetuta. La titolazione può essere eseguita contemporaneamente su più righe. Dopo aver titolato l'intera fila, il titolatore viene lavato con acqua distillata (con un cambio di 2 porzioni) mediante movimenti rotatori, l'acqua viene rimossa dalla testa con un tampone e bruciata sulla fiamma del bruciatore.

Dopo la titolazione, aggiungere nei pozzetti 25 µl di erythrocyte diagnosticum.

La concentrazione di diagnosticum per RPHA in microvolumi dovrebbe essere dello 0,5% (cioè la sospensione di eritrociti al 2,5% viene ulteriormente diluita 5 volte). Dopo aver aggiunto gli eritrociti, le piastre devono essere agitate delicatamente fino ad ottenere una sospensione omogenea. I risultati possono essere registrati entro 1-1,5 ore, che è un vantaggio significativo di RPHA in un microtitolo.

Inoltre, questa tecnica richiede una piccola quantità di tutti gli ingredienti di reazione e dei sieri di prova.

La reazione viene presa in considerazione secondo il seguente schema:

1) "+" - emoagglutinazione a tutti gli effetti, in cui gli eritrociti cadono sul fondo del foro in uno strato uniforme sotto forma di "ombrello", occupando almeno i 2/3 del fondo;

2) "+ -" - emoagglutinazione parziale, in cui gli eritrociti cadono sul fondo sotto forma di un anello sciolto di piccole dimensioni;

3) "-" - assenza di emoagglutinazione, quando gli eritrociti cadono sul fondo sotto forma di un piccolo bottone o un ricciolo con un bordo uniforme.

La specificità di un risultato positivo ottenuto in RPHA può essere verificata utilizzando una reazione a tre componenti - reazione di inibizione dell'emoagglutinazione passiva (RPHA).

Tecnica per la messa in scena dell'RTPGA.

Questa reazione viene utilizzata per confermare la specificità di un risultato RPHA positivo quando è discutibile o di particolare interesse epidemiologico. Il meccanismo di reazione consiste in una specifica inibizione dell'emoagglutinazione quando al siero in esame viene aggiunta una sospensione di batteri tularemici uccisi. Tre componenti interagiscono nella reazione: il siero testato, l'antigene specifico della tularemia e l'antigenico diagnostico eritrocitario RTPHA sono solitamente posti in una fila di 7-8 pozzetti.

Si consiglia di installare un secondo RPGA in parallelo con l'RTPHA. Si versano 0,25 ml del liquido di diluizione in due file di pozzetti, quindi nei primi pozzetti di entrambe le file si aggiunge il siero in esame in volume di 0,25 ml e si titola Si ottengono due serie identiche di diluizioni di siero. Aggiungere 0,25 ml di liquido diluente a tutti i pozzetti della seconda fila e 0,25 ml di sospensione di batteri della tularemia ai pozzetti della prima fila.

Viene utilizzato Tularemia diagnosticum (contenente 25 miliardi di batteri della tularemia in 1 ml), precedentemente diluito 50 volte.

Questa sospensione contiene 500 milioni di batteri in 1 ml o 125 milioni in un volume di 0,25 ml. Dopo aver aggiunto l'antigene, la piastra viene lasciata per 1 ora a temperatura ambiente, dopo di che viene aggiunta una goccia (0,05 ml) di erythrocyte diagnosticum a tutti i pozzetti di entrambe le file, la piastra viene agitata e lasciata su una superficie piana del tavolo.

La contabilità viene eseguita in 2-3 ore.

Contabilità e valutazione di RTPHA. Se il siero del test contiene anticorpi specifici per la tularemia, questi vengono neutralizzati dall'antigene aggiunto e l'emoagglutinazione non si verifica nella prima fila di pozzetti, oppure, con un titolo sierico elevato, l'emoagglutinazione sarà rilevata in un numero inferiore (di 2-4). di pozzi rispetto alla fila con RPHA. In questo caso, la specificità dei risultati è confermata.

Se si nota emoagglutinazione in entrambe le file, ad es. i risultati di RTPHA e RPHA coincidono, questo indica l'assenza di anticorpi della tularemia nel siero testato. In questo caso, il risultato primario di RPHA è riconosciuto come non specifico.

Tecnica per impostare RTPGA in microvolumi. RTPHA, così come RPHA, possono essere eseguiti in microvolumi utilizzando un microtitolo di tipo Takachi.

Per fare ciò, nei pozzetti delle micropiastre vengono introdotti 0,25 μl di un liquido diluente in due file di 7-8 pozzetti ciascuna. Quindi, utilizzando un titolatore, vengono valutati 0,25 μl del siero in esame e titolati in entrambe le righe. Successivamente, 25 μl di antigene della tularemia (la cui concentrazione è di 500 milioni di batteri della tularemia in 1 ml) vengono aggiunti a ciascun pozzetto nella prima riga e 25 μl di liquido di diluizione vengono aggiunti alla seconda riga.

Le piastre vengono lasciate per 1 ora a temperatura ambiente, dopodiché vengono aggiunti 25 μl di spettrociti diagnostici antigenici (concentrazione 0,5%) a tutti i pozzetti di entrambe le file.

I risultati vengono presi in considerazione e valutati in modo simile alla reazione in macrovolumi.

Data di pubblicazione: 2015-02-03; Leggi: 3176 | Violazione del copyright della pagina

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La reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA) è un metodo per identificare un virus o rilevare anticorpi antivirali nel siero del sangue del paziente, basato sul fenomeno dell'assenza di agglutinazione degli eritrociti da parte di un farmaco contenente un virus in presenza di siero immune ad esso.

La reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA) si basa sul blocco, la soppressione degli antigeni virali da parte degli anticorpi del siero immunitario, a seguito della quale i virus perdono la capacità di agglutinare gli eritrociti.

RTGA viene utilizzato per diagnosticare molte malattie virali, i cui agenti causali (influenza, morbillo, rosolia, virus dell'encefalite trasmessa da zecche, ecc.) Possono agglutinare gli eritrociti di vari animali.

Meccanismo. La tipizzazione del virus viene effettuata nella reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (RTGA) con una serie di sieri tipo-specifici. I risultati della reazione vengono presi in considerazione in assenza di emoagglutinazione.

I sottotipi del virus A con antigeni H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 e altri possono essere differenziati in RTGA con una serie di sieri omologhi tipo-specifici.

Reazione di legame del complemento. Meccanismo. Componenti. Applicazione

La reazione di legame del complemento (CSC) è che quando antigeni e anticorpi corrispondono tra loro, formano un complesso immunitario, a cui il complemento (C) è attaccato attraverso il frammento Fc di anticorpi, cioè il complemento è legato da un antigene-anticorpo complesso. Se il complesso antigene-anticorpo non si forma, il complemento rimane libero.

L'interazione specifica di AG e AT è accompagnata dall'adsorbimento (legame) del complemento. Poiché il processo di legame del complemento non si manifesta visivamente, J. Bordet e O. Zhangu hanno suggerito di utilizzare il sistema emolitico (eritrociti di pecora + siero emolitico) come indicatore, che mostra se il complemento è fissato dal complesso AG-AT. Se AG e AT corrispondono l'uno all'altro, cioè si forma un complesso immunitario, il complemento è legato a questo complesso e l'emolisi non si verifica. Se AT non corrisponde ad AH, allora il complesso non si forma e il complemento, pur rimanendo libero, si connette con il secondo sistema e provoca l'emolisi.

Componenti. Il test di fissazione del complemento (CBC) è una reazione sierologica complessa. Per la sua attuazione sono necessari 5 ingredienti, ovvero: AG, AT e complemento (primo sistema), eritrociti di pecora e siero emolitico (secondo sistema).

L'antigene per CSC può essere colture di vari microrganismi uccisi, loro lisati, componenti di batteri, organi patologicamente alterati e normali, lipidi tissutali, virus e materiali contenenti virus.

Il siero di cavia fresco o secco viene utilizzato come complemento.

Meccanismo. RSK viene effettuato in due fasi: 1a fase - incubazione di una miscela contenente tre componenti antigene + anticorpo + complemento; 2a fase (indicatore) - rilevamento del complemento libero nella miscela aggiungendovi un sistema emolitico costituito da eritrociti di pecora e siero emolitico contenente anticorpi contro di essi. Nella 1a fase della reazione, quando si forma il complesso antigene-anticorpo, il complemento è legato da esso, e quindi nella 2a fase non si verificherà l'emolisi degli eritrociti sensibilizzati dagli anticorpi; la reazione è positiva. Se l'antigene e l'anticorpo non corrispondono (non c'è antigene o anticorpo nel campione in esame), il complemento rimane libero e nella 2a fase si unirà al complesso eritrocita-anticorpo anti-eritrocita, provocando l'emolisi; la reazione è negativa.

Applicazione. RSK è usato per diagnosticare molte malattie infettive, in particolare la sifilide (reazione di Wasserman).

ELISA in fase solida- una variante del test, quando uno dei componenti della risposta immunitaria (antigene o anticorpo) viene assorbito su un supporto solido, ad esempio nei pozzetti delle piastre di polistirene. I componenti vengono rilevati mediante l'aggiunta di anticorpi o antigeni marcati. Se il risultato è positivo, il colore del cromogeno cambia. Dopo ogni aggiunta del componente successivo, i reagenti non legati vengono rimossi dai pozzetti mediante lavaggio,

I. Quando si determinano gli anticorpi (figura a sinistra), il siero del sangue del paziente, il siero antiglobulina marcato con enzima e il substrato/cromogeno per l'enzima vengono aggiunti in sequenza ai pozzetti delle piastre con l'antigene assorbito.

II. Quando si determina l'antigene (figura a destra), un antigene (ad esempio, siero sanguigno con l'antigene desiderato) viene aggiunto ai pozzetti con anticorpi adsorbiti, un siero diagnostico contro di esso e anticorpi secondari (contro un siero diagnostico) marcati con un enzima, e poi si aggiunge un substrato/cromogeno per l'enzima.

ELISA competitivo per determinare gli antigeni: l'antigene bersaglio e l'antigene marcato con l'enzima competono tra loro per legare un numero limitato di anticorpi del siero immunitario.

Un altro test è il Competitive ELISA per la determinazione degli anticorpi: gli anticorpi target e gli anticorpi marcati con enzimi competono tra loro per gli antigeni adsorbiti sulla fase solida.

Immunoblotting- un metodo altamente sensibile per la rilevazione delle proteine ​​basato su una combinazione di elettroforesi ed ELISA o RIA. L'immunoblotting viene utilizzato come metodo diagnostico per l'infezione da HIV, ecc.

Gli antigeni patogeni vengono separati mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide, quindi trasferiti dal gel su carta attivata o membrana di nitrocellulosa e sviluppati mediante ELISA. Le aziende producono tali strisce macchiate di antigene. Il siero del paziente viene applicato su queste strisce. . Quindi, dopo l'incubazione, gli anticorpi non legati del paziente vengono lavati via e viene applicato il siero contro le immunoglobuline umane marcate con l'enzima . Il complesso formato sulla striscia [antigene + anticorpo del paziente + anticorpo contro Ig umane] viene rilevato aggiungendo un substrato cromogenico che cambia colore sotto l'azione di un enzima.