Există multe metode pentru determinarea calitativă și cantitativă a anticorpilor specifici virusului. Folosind aceste metode, este posibil să se detecteze atât IgM cât și IgG simultan, și separat imunoglobulinele din fiecare clasă. De regulă, numai IgG-urile specifice virusului sunt detectate în reacția de legare a complementului. Cu toate acestea, atunci când se testează antigeni microbiologici prin această metodă, este posibil să se determine simultan IgM și IgG specifice.

Metodele imunologice sunt utilizate în principal în două scopuri: în primul rând, pentru a diagnostica o infecție virală curentă, finalizată sau congenitală și, în al doilea rând, pentru a detecta anticorpi specifici, a căror prezență indică o infecție trecută și, prin urmare, imunitatea la o posibilă reinfecție. În ceea ce privește puterea răspunsului imun la o infecție virală, oamenii sunt foarte diferiți unul de celălalt. În fig. 3 prezintă o curbă tipică de creștere a titlului

anticorpi ca răspuns la infecția primară cu rubeolă. Este ușor de văzut că diagnosticul de rubeolă este posibil prin creșterea titrului IgG specifice și identificarea IgM specifice. Prezența IgM specifice în sângele unui nou-născut indică infecție intrauterină, deoarece IgM materne, spre deosebire de IgG, sunt reținute de placentă. IgG specifice din infecția primară persistă de obicei pe tot parcursul vieții. Prin urmare, prezența anticorpilor din această clasă în serul sanguin indică imunitate la reinfecția corespunzătoare.

Mai jos sunt metode imunologice pentru detectarea anticorpilor specifici împotriva virusului rubeolei, care sunt deosebit de eficiente pentru diagnosticarea bolii fetale și determinarea titrului anticorpilor specifici din serul sanguin. Descrieri detaliate metodele utilizate pentru diagnosticarea rubeolei pot fi găsite în recenziile lui Pattison și Morgan-Kapner.

Reacția de inhibare a hemaglutinării

Virusul rubeolei provoacă hemaglutinarea celulelor roșii din sânge la multe specii de animale. Cel mai adesea, eritrocitele găinilor de o zi sunt utilizate în RTGA. În această reacție, virusul crescut în cultură și tratat cu Tween 80 și eter este antigenul hemaglutinant al virusului rubeolei. Pretratarea crește titrul HA al virusului.

5.1.1 Standardizarea antigenului HA al virusului rubeolei

1. 1 ml dintr-o suspensie de 50% de eritrocite de pui se spală de trei ori în tampon Veronal cu dextran și gelatină prin centrifugare și resuspendare a peletei într-un tub de centrifugă gradat de 15 ml. Celulele spălate sunt resuspendate în tampon DGV pentru a obține o suspensie de 30%.

Tabelul 3. Pregătirea tamponului Veronal cu Dextran și gelatină

1. Soluție tampon DGV

Tablete tampon de reacție de legare complementare 20

Sodiu Veronal 400 mg Gelatină 1200 mg Apă distilată 2000 ml Se dizolvă comprimatele în apă distilată. Se adaugă sodiu veronal și gelatină. Asezat in baie de apă la 56 ° C până când gelatina se dizolvă complet. Turnat în sticle de 100 ml. Autoclavează și păstrează la 4 ° C

2,25% BSA

BSA, fracțiunea 5 25 g Apă distilată sterilă 100 ml

Sterilizat prin filtrare, turnat în fiole sterile de 1 ml. Depozitați la - 20 "C

Glucoză 3,10%

Glucoză 10 g Apă distilată 100 ml Se distribuie câte 1 ml fiecare. Autoclavează și păstrează la 4 ° C

4. Pentru utilizare

Soluție tampon DGV 100 ml 25% BSA 0,8 ml 10% glucoză 1,0 ml A se păstra la 4 ° C

2. Diluați preparatul liofilizat al antigenului HA al virusului rubeolei în volumul de apă distilată necesar conform instrucțiunilor.

3. Adăugați 1 volum de DGV la fiecare dintre cele opt godeuri din două rânduri adiacente ale unei plăci de microtitrare din polistiren cu 96 de godeuri cu godeuri U-by-different.

4. În primele godeuri din două rânduri, se adaugă un volum al antigenului HA al virusului rubeolei.

5. Diluțiile serice de două ori ale antigenului rubeolei HA, variind de la 1: 2 la 1: 256, sunt preparate folosind un microtitrare de 0,025 ml. Înainte de utilizare, capul microtitratorului trebuie calcinat într-o flacără roșie fierbinte, apoi răcit câteva secunde, plasat în apă distilată și șters cu hârtie de filtru.

6. Adăugați un volum suplimentar de tampon DGV la fiecare dintre godeurile umplute. Ca control, două volume de tampon DGV sunt adăugate la puțurile 12 din primele două rânduri.

7. Suspensia de eritrocite de pui spălate este diluată de 100 de ori cu tampon DGV, obținându-se astfel o suspensie de 0,03%.

8. În toate cele 18 godeuri se adaugă două volume de 0,03% suspensie de eritrocite, placa finită este acoperită cu o altă placă neutilizată și incubată 1 oră la 4 ° C.

9. În partea de jos a puțurilor de control se formează o „placă” densă de eritrocite neaglutinate. Eritrocitele aglutinate se instalează uniform. Titrul HA este considerat reciproc cu cea mai mare diluare a antigenului HA al virusului rubeolei, la care apare încă aglutinarea completă. Această diluție conține 1 unitate de hemaglutinare.

Pentru testarea serurilor, se utilizează 4 unități GA de antigen de rubeolă. Astfel, dacă titrul antigenului GA este 32, atunci pentru a detecta anticorpii împotriva virusului rubeolei, acesta se diluează cu DGV de opt ori. Antigenul diluat este stabil timp de 25-48 ore la 4 ° C.

5.1.2 Pretratarea zerului

Toate serurile conțin inhibitori nespecifici de hemaglutinare care ar trebui îndepărtați. Inhibitorii GA nespecifici sunt în principal lipoproteine, care sunt eliberate prin tratarea serului cu caolin. În plus, în serurile umane pot fi prezente aglutinine nespecifice ale eritrocitelor de pui. Cu toate acestea, adsorbția preliminară a serurilor testate de către eritrocite nu este necesară, deoarece toate hemaglutininele nespecifice prezente în seruri se găsesc în martori.

1. În eprubete numerotate din sticlă se adaugă 0,2 ml de ser. În plus față de serurile studiate, sunt necesare controale pozitive și negative în fiecare experiment.

2. Adăugați 0,8 ml de caolin 25% în soluție tampon borat-salină în fiecare tub.

3. Conținutul tuburilor este agitat și lăsat la temperatura camerei timp de 20 de minute.

4. Caolinul uzat este precipitat prin centrifugare într-o centrifugă de masă la 2000 rpm timp de 20 de minute.

5. Transferați supernatantul în tuburi curate, numerotate. Ca rezultat al purificării, se obține ser, diluat de patru ori. Acestea sunt utilizate pentru a formula o reacție de inhibare a hemaglutinării. Serul poate fi păstrat la 4 ° C peste noapte.

5.1.3 Inhibarea reacției hemaglutinării

1. Pentru a testa o probă de ser, adăugați un volum de DGV la un rând de godeuri.

2. Adăugați un volum de ser diluat de patru ori la prima și ultima godeuri.

3. Folosind un microtitrator, pregătiți diluții secvențiale de două ori ale serului.

4. În godeurile 1-10 se adaugă un volum de antigen GA rubeolă conținând 4 GAU. Antigenul rubeolei GA nu este adăugat în puțul 12.

5. În godeurile 1-8 ale unei alte plăci, se adaugă un volum al diluției de lucru a antigenului rubeolei HA și apoi în opt godeuri se prepară diluții succesive de două ori ale antigenului HA. La aceste 16 puțuri se adaugă un volum de DGV. Această titrare este un test pentru antigenul rubeolei HA. Pentru control, două volume de DGV sunt adăugate la puțurile 12 din primul și al doilea rând.

6. Plăcile acoperite se lasă 1 oră la temperatura camerei sau peste noapte la 4 ° C.

7. În toate godeurile umplute, se adaugă două volume de 0,03% suspensie de eritrocite de pui și plăcile sunt lăsate timp de 1 - 1,5 ore la 4 ° C.

8. Vizualizând plăcile, determinați titrul antigenului rubeolei HA. Nu trebuie să apară aglutinare în godeurile de control.

9. Dacă eritrocitele serice s-au aglomerat în absența antigenului rubeolei GA, este necesar să se testeze din nou diluția serică inițială. Înainte de aceasta, serul este adsorbit cu o picătură de 30% suspensie de eritrocite de pui timp de 1 oră la temperatura camerei, apoi eritrocitele sunt precipitate prin centrifugare.

10. Titrul anticorpilor specifici din serul studiat este considerat reciproc al diluției, la care hemaglutinarea este complet suprimată.

5.1.4 Interpretarea rezultatelor

Cu un titru scăzut, este dificil de interpretat rezultatele, deoarece cu o diluție mică, este posibilă prezența reziduală a inhibitorilor nespecifici. Prezența anticorpilor specifici virusului este considerată dovedită la un titru de 16 sau mai mare.

Reacția de inhibare a hemaglutinării (RTGA) este o metodă de identificare a unui virus sau de detectare a anticorpilor antivirali în serul sanguin al pacientului, bazată pe fenomenul absenței aglutinării eritrocitelor de către un medicament care conține un virus în prezența serului imun la acesta.

Mulți viruși au capacitatea de a aglutina eritrocitele speciilor strict definite de mamifere și păsări. Deci, virusurile gripale și ale oreionului aglutinează eritrocitele găinilor, porcușori de Guineea, umane și adenovirusuri - eritrocite de șobolani și șoareci. În acest sens, pentru detectarea lor în materialul pacienților sau în culturi de celule, embrioni și animale, este stabilită reacția de hemaglutinare (RHA). Pentru aceasta, în godeurile plăcilor se prepară diluții în creștere dublă a materialelor și lichidelor vaccinate, adăugându-le suspensii eritrocitare de NaCI spălate cu o soluție izotonică. Pentru a controla aglutinarea spontană, eritrocitele sunt amestecate cu un volum egal de soluție izotonică de NaCl. Amestecurile sunt incubate într-un termostat la 37 ° C sau la temperatura camerei.

Rezultatele RGA sunt luate în considerare de natura aglutinării eritrocitelor după 30-60 de minute, când sunt de obicei complet precipitate în control. Reacțiile pozitive sunt indicate de plusuri. "++++" - sediment sub formă de "umbrelă", "+++" - sediment cu goluri, "++" - sediment cu goluri mari, "+" - sediment floculent înconjurat de o zonă de eritrocite mototolite , și "-" - același sediment clar conturat al eritrocitelor sub forma unui "buton", ca și în control.

Fiind specifică grupului, RHA nu face posibilă determinarea speciilor care aparțin virușilor. Acestea sunt identificate folosind reacția de inhibare a hemaglutinării (HAI). Pentru stabilirea acestuia, se utilizează seruri antivirale imune cunoscute, care sunt diluate într-o soluție izotonică de clorură de sodiu în concentrații de două ori descrescătoare și turnate în godeuri. La fiecare dintre diluțiile lor se adaugă o cantitate egală de lichid vaccinat. Controlul este o suspensie a virusului în soluție izotonică de clorură de sodiu. Plăcile cu un amestec de seruri și virusuri sunt păstrate într-un termostat timp de 30 de minute sau la temperatura camerei timp de 2 ore, apoi se adaugă o suspensie de eritrocite la fiecare dintre ele. După 30 de minute, se determină titrul serului neutralizant (adică diluția sa maximă), care a provocat o întârziere în aglutinarea eritrocitelor.

RTGA este utilizat în diagnosticul serologic al bolilor virale, în special al infecțiilor cu gripă și adenovirus. Este mai bine să îl puneți în același mod ca PH, cu seruri împerecheate. O creștere de patru ori a titrului anticorpului în al doilea ser confirmă diagnosticul prezumtiv.

Reacția de inhibare a hemaglutinării (RTGA) se bazează pe blocarea, suprimarea antigenelor virale de către anticorpii serului imun, ca urmare a căreia virușii își pierd capacitatea de a aglutina eritrocitele.

Mecanism. Tipul virusului se efectuează în reacția de inhibare a hemaglutinării (RTGA) cu un set de seruri de tip specific. Rezultatele reacției sunt luate în considerare în absența hemaglutinării. Subtipurile de virus A cu antigene H 0 N 1, H 1 N 1, H 2 N 2, H 3 N 2 etc. pot fi diferențiate în RTGA cu un set de seruri omogene de tip specific.

Recent, reacția a fost utilizată pe scară largă în laboratoarele de virologie clinică pentru a determina titrurile anticorpilor specifici împotriva anumitor viruși, precum și pentru identificarea serologică și tiparea izolatelor de virus din materialul clinic de la pacienți. Acestea sunt utilizate oarecum limitate datorită prezenței în serul sanguin a oamenilor a inhibitorilor nespecifici ai virusurilor, precum și a anticorpilor naturali - aglutinine.

Principiul RTGA constă în amestecarea volumelor egale de ser din sânge și a unei suspensii de virus într-o eprubetă, iar după expunere se determină dacă virusul este conservat în amestec prin adăugarea unei suspensii de eritrocite. Aglutinarea eritrocitelor indică prezența, iar absența hemaglutinării indică absența unui virus în amestec. Dispariția virusului din amestecul de virus + ser este considerată ca un semn al interacțiunii anticorpilor serici cu virusul.

Dar anticorpii interacționează cu antigenii în raporturi cantitative strict definite. Prin urmare, pentru ca o anumită cantitate de virus să fie privată de capacitatea de hemaglutinare, este necesar un anumit minim de anticorpi și întrucât una dintre componentele RTGA este întotdeauna necunoscută, este necesar să puneți reacția într-un rând de eprubete cu doze diferite de anticorpi și aceleași doze de virus sau invers. Acest lucru se realizează luând fie diluții serice diferite și aceeași diluție de virus, fie diluții de virus diferite și aceeași diluție serică.

RTGA permite rezolvarea următoarelor sarcini: determinarea titrului anticorpilor împotriva virusului hemaglutinant în ser; identifica virusul hemaglutinant necunoscut prin seruri cunoscute; pentru a stabili gradul de relație antigenică a doi viruși.

Avantajele RTGA: simplitatea tehnologiei, viteza, munca sterilă nu este necesară, specificitatea, costul redus. Dezavantaj: RTGA este posibil doar cu viruși hemaglutinați.

Principiul titrării anticorpilor în RTGA este după cum urmează:

- pregătiți o serie de diluții secvențiale (de obicei de 2 ori) ale serului testat în volume egale (de obicei 0,25 sau 0,2 ml);

- la fiecare diluare se adaugă aceleași volume de virus omolog într-un titlu de 4 HAU;

- amestecurile se păstrează o anumită perioadă de timp la o anumită temperatură (pentru virusul bolii Newcastle 40-60 minute la temperatura camerei);

- la toate amestecurile se adaugă volume egale de 1% suspensie de eritrocite spălate;

- după expunere, evaluați hemaglutinarea în fiecare amestec în cruci.

Reacția include martori pentru ser, virus și eritrocite.

Cea mai mare diluție serică, care încă inhibă complet hemaglutinarea, este luată ca indicator al titrului anticorpului din acest ser.

Utilizarea reacțiilor de hemadsorbție în virologie.

RGAD. Hemadsorbția - conexiunea eritrocitelor cu suprafața celulelor afectate de virus - a fost descoperită pentru prima dată de Vogel și Shchelokov (1957) pe o cultură tisulară infectată cu virusul gripal. Acest fenomen se bazează pe relația dintre receptorii virusului localizați pe suprafața celulei afectate cu receptorii eritrocitari, ceea ce duce la aderența lor reciprocă similară cu reacția de hemaglutinare. Avantajul acestei reacții este că devine pozitivă chiar înainte de apariția unor modificări citopatice distincte în celulele infectate.

Metodologia RGAD este după cum urmează. În a 3-4-a zi după infectarea celulelor, luați două tuburi cu aceeași cultură de celule, dintre care unul este infectat cu material vaccinat, iar al doilea este unul de control. Lichidul de cultură este drenat din ambele eprubete și se adaugă 2-3 picături de 0,5% suspensie de eritrocite spălate. Ambele tuburi sunt lăsate timp de 5-10 minute, astfel încât eritrocitele să fie la suprafața celulelor (așezate orizontal pe masă), apoi clătite ușor cu soluție salină și examinate la microscop (mărire redusă). În tubul de control, eritrocitele sunt complet îndepărtate cu soluție salină, iar unele dintre cele rămase plutesc cu lichidul. Dacă într-o eprubetă infectată eritrocitele nu sunt îndepărtate cu ser fiziologic și nu plutesc, ci sunt atașate la suprafața celulelor, RHAD trebuie considerat pozitiv.

În funcție de virus și de tipul de celule, localizarea celulelor roșii din sânge poate fi de trei ori:

- eritrocitele sunt adsorbite numai de-a lungul periferiei stratului celular sub forma unui „colier” (virusul pestei porcine africane);

- eritrocitele sunt localizate pe stratul celular în focare sau grupuri (virus gripal);

- eritrocitele sunt localizate difuz pe stratul celular (virusul parainfluenza).

Fiecare virus este capabil să adsorbă globulele roșii ale anumitor tipuri de animale.

Diagnosticul serologic al bolilor virale bazat pe creșterea titrului anticorpilor în serurile de sânge pereche.

Reacția de hemaglutinare (RHA) și reacția de inhibare a hemaglutinării (RTGA), mecanismul, componentele și aplicarea reacțiilor.

Reacția de hemaglutinare se bazează pe fenomenul aderenței eritrocitelor, care are loc sub influența diverșilor factori. Distingeți între hemaglutinare directă și indirectă.

În primul rând, eritrocitele sunt spălate cu o soluție izotonică de clorură de sodiu, apoi, dacă este necesar (atunci când se utilizează antigene cu caracter proteic), acestea sunt tratate cu o soluție de tanin 1: 20.000 și sensibilizate cu antigeni solubili. După spălare cu o soluție tamponată de clorură de sodiu izotonică, antigenul eritrocitar este gata de utilizare.

Serurile studiate sunt diluate cu soluție de clorură de sodiu izotonică în eprubete sau plăci de plastic speciale cu godeuri, apoi la fiecare diluție serică se adaugă diagnosticul eritrocitar. Rezultatele reacției de hemaglutinare indirectă sunt luate în considerare de natura sedimentului eritrocitar format la fundul eprubetei. Rezultatul reacției este considerat pozitiv, în care globulele roșii acoperă uniform întregul fund al eprubetei. În cazul unei reacții negative, eritrocitele sub formă de disc mic sau „buton” sunt situate în centrul fundului eprubetei

Principalele componente ale PR:

A) antigen solubil,

B) Anticorpi specifici (ser)

(RTGA) este o metodă de identificare a unui virus sau de detectare a anticorpilor antivirali în serul sanguin al pacientului, bazată pe fenomenul absenței aglutinării eritrocitelor de către un medicament care conține un virus în prezența serului imun la acesta.
pe baza blocării, suprimarea antigenelor virusurilor de către anticorpii serului imunitar, în urma cărora virușii își pierd capacitatea de a aglutina eritrocitele.

RTGA este utilizat pentru a diagnostica multe boli virale, ale căror agenți cauzali (gripă, rujeolă, rubeolă, virusuri ale encefalitei transmise prin căpușe etc.) pot aglutina eritrocitele diferitelor animale.
Mecanism. Tipul virusului se efectuează în reacția de inhibare a hemaglutinării (RTGA) cu un set de seruri de tip specific. Rezultatele reacției sunt luate în considerare în absența hemaglutinării. Subtipuri de virus A cu antigeni H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 etc.

poate fi diferențiat în RTGA cu un set de seruri omogene de tip specific.

În inima reacții de hemaglutinare se află fenomenul aderenței eritrocitelor, care are loc sub influența diverșilor factori.

Distingeți între hemaglutinare directă și indirectă.
În reacția hemaglutinării directe, eritrocitele se lipesc când anumite antigene, cum ar fi virușii, sunt adsorbite pe ele.
În studiile serologice, se utilizează o reacție directă de inhibare a hemaglutinării, atunci când un virus izolat de la un pacient este neutralizat cu un ser imun specific și apoi combinat cu eritrocite.

Absența hemaglutinării indică corespondența virusului și a serului imun folosit.

Reacția de hemaglutinare indirectă (hemaglutinare pasivă) se observă atunci când serul imun sau serul pacientului având anticorpii corespunzători se adaugă la eritrocitele tratate anterior (sensibilizate) cu diverși antigeni.

Există o lipire specifică a eritrocitelor, hemaglutinarea lor pasivă.

Reacția hemaglutinării indirecte sau pasive în sensibilitate și specificitate este superioară altor metode serologice și este utilizată în diagnosticul infecțiilor cauzate de bacterii, rickettsia, protozoare.

Tehnica etapizării reacției de hemaglutinare indirectă constă în mai multe etape.

După spălare cu o soluție tamponată de clorură de sodiu izotonică, antigenul eritrocitar este gata de utilizare. Serurile studiate sunt diluate cu soluție de clorură de sodiu izotonică în eprubete sau plăci de plastic speciale cu godeuri, apoi la fiecare diluție serică se adaugă diagnosticul eritrocitar.

Rezultatele reacției de hemaglutinare indirectă sunt luate în considerare de natura sedimentului eritrocitar format la fundul eprubetei. Rezultatul reacției este considerat pozitiv, în care globulele roșii acoperă uniform întregul fund al eprubetei. Dacă reacția este negativă, celulele roșii din sânge sub forma unui mic disc sau „buton” sunt situate în centrul fundului eprubetei.

Reacția de inhibare a hemaglutinării- o reacție serologică bazată pe capacitatea anticorpilor de a preveni aglutinarea eritrocitelor prin virusuri hemaglutinate (adenovirusuri, arbovirusuri, unele enterovirusuri, virusuri gripale și parainfluențiale, rujeolă, reovirusuri).

Anticorpii antivirali specifici interacționează cu moleculele de hemaglutinină de suprafață ale virionilor acestor viruși și blochează legarea lor de molecule de membrană eritrocitară complementare.

Acestea sunt utilizate oarecum limitate datorită prezenței în serul sanguin a oamenilor a inhibitorilor nespecifici ai virusurilor, precum și a anticorpilor naturali - aglutinine.

Reacția de neutralizare este o reacție de inhibare a hemaglutinării (RTGA).

RTGA este aplicat:
-pentru serotiparea virusurilor;
- pentru serodiagnosticul infecțiilor.
Există două moduri de organizare:
- metoda de picurare pe sticlă (reacție aproximativă), utilizată pentru copierea gri a virușilor;
- desfășurat în eprubete.

Mecanism.

Unii viruși (de exemplu, gripa) au hemaglutinină, care determină aglutinarea globulelor roșii la diferite animale, în funcție de tipul de virus.

În prezența anticorpilor în ser - antihemagglutinine, se observă inhibarea activității virușilor.
RTGA.
Obiectiv: Serotipizarea virusului gripal A

Componente:
1. Material de testare - lichid alantoic al unui embrion de pui,
2. Ser anti-gripal specific tipului de diagnosticare,
3,5% suspensie de eritrocite de pui.
4.

Salină.

Reacția este pusă pe sticlă prin metoda picăturii. Aplicați 1 picătură de seruri de diagnosticare și material de testat pe sticlă, amestecați, apoi adăugați 1 picătură de suspensie de eritrocite. Cu o reacție pozitivă, se observă roșeață omogenă și, cu o reacție negativă, cad fulgi roșii (hemaglutinare).

AnteriorUrmătorul

Caracterizarea virusurilor gripale. Epidemiologie și diagnostic de gripă. Utilizarea RTGA pentru serotipizarea virusurilor gripale. Preparate pentru profilaxie și tratament specific.

Gripa sau gripa - acuta infecţie caracterizată prin deteriorarea mucoaselor superioare tractului respirator, febră, intoxicație generală, activitate afectată a sistemului cardiovascular și nervos.

Gripa se caracterizează printr-o tendință de răspândire epidemică și pandemică datorită contagiozității și variabilității ridicate a agentului patogen.

Caracteristicile agenților patogeni. Agenții patogeni - virusurile gripale aparțin acestei. Orthomyxoviridae, genurile Influenzavirus A, B și Influenzavirus C. Virusurile gripale sunt virusuri ARN. Virusul gripal de tip A a fost izolat în 1933 de W. Smith, K. Andrews, P. Laidlaw. În 1940 T.

Aplicarea metodei de hemaglutinare în virologie.

Francis și R. Medgill au izolat virusuri gripale de tip B, în 1949 R. Taylor - tip C. În Rusia, primii virusuri gripali au fost izolați în 1936 de A. A. Smorodintsev și clasificați ca tip A. Morfologie. Virușii gripali au o formă sferică (formă de bilă) - 80 - 120 nm, mai rar au o formă filamentoasă. Acestea constau din: 1) un nucleu - o nucleocapsidă cu un tip de spirală de simetrie (linie monocatenară "-" -cord de ARN + capsidă proteică); 2) membrana bazală - membrană lipoproteică externă - supercapsidă.

Pe suprafața plicului există 2 tipuri de glicoproteine (sub formă de spini și vilozități): 1) hemaglutinină - favorizează atașarea receptorilor celulari; 2) neuraminidaza - favorizează eliberarea virusului din celulă. Cultivare. Pentru cultivare se folosesc embrioni de pui, culturi de celule trypsinizate primare și, uneori, animale de laborator.

Cel mai convenabil model sunt embrionii de pui cu vârsta cuprinsă între 10-12 zile. Vă permite să obțineți cantități mari de virus, care este necesar în producerea de vaccinuri și preparate bacteriene.

Infecția se efectuează în cavitatea alontoică, în membrana corion-alontoică, în cavitatea amniotică, în amnion. Prezența virusului în embrionul de pui este detectată în reacția de hemaglutinare. Structura antigenică. Virușii au un antigen intern - S și antigeni de suprafață: HA-hemaglutinină și NA-neuraminidază. Antigenul S este specific grupului, comun întregului tip, pentru acest antigen virusurile gripale sunt împărțite în tipurile A, B și C. Este un antigen stabil (neschimbător) care se leagă de complement.

Antigenele HA și NA sunt antigene specifice. Antigenul HA determină formarea de anticorpi neutralizanți ai virusului și aderența eritrocitelor.

Antigenul NA determină formarea de anticorpi care neutralizează parțial virusurile.

Virusul de tip B este mai puțin variabil, iar tipul C este foarte stabil.

Proprietăți toxice. Efectul toxic al virusului asupra organismului ( durere de cap, dureri musculare, temperatura, fenomenele catarale) este cauzată de proteinele virusului (cea mai virală particulă). Această acțiune este strict specifică și este neutralizată doar de serul imun de tipul sau subtipul corespunzător sau de serul celor care au fost bolnavi. Rezistenţă. Virușii gripali sunt sensibili la razele UV, dezinfectanți (formalină, alcool, fenol, cloramină) și solvenți grași.

În mediu lichid, ele mor la o temperatură de 50 - 60 ° C în câteva minute. La temperatura camerei din aer, virușii rămân infecțioși câteva ore. Se păstrează mult timp sub formă uscată, iar într-o stare înghețată (-70 ° C) nu numai că persistă mult timp, dar, de asemenea, nu pierd virulența.

Sensibilitatea animalelor. În condiții naturale, virușii de tip A infectează oamenii și animalele (caii, porcii se îmbolnăvesc), iar virusurile de tipul B și C - numai oamenii. Printre animalele de laborator, șoarecii albi, dihorii africani, hamsterii sirieni și maimuțele sunt susceptibile la viruși.

Boala la animale se caracterizează prin leziuni pulmonare, o stare febrilă și poate duce la moartea animalelor. Epidemiologia bolii. Sursa infecției este o persoană bolnavă cu o formă exprimată clinic sau asimptomatică. O persoană bolnavă eliberează virusul în mediu atunci când tuse, vorbește, strănutează cu picături de salivă, mucus, spută deja în perioada de incubație.

Pacientul devine contagios cu 24 de ore înainte de apariția principalelor simptome și prezintă un pericol epidemic în 48 de ore de la dispariția lor.

Mecanismul de transmisie este aerogen. Traseul de transmisie este aerian. Oamenii sunt foarte susceptibili la gripă. Toate grupele de vârstă sunt bolnave, în principal iarna. Cei mai sensibili sunt copiii și vârstnicii. Numele bolii reflectă trăsăturile epidemiologiei: gripa din limba franceză. gripper - a apuca, gripa - din italiană. Influenza di freddo - influența frigului.

Dintre toate ascuțitele afectiuni respiratorii gripa este cea mai răspândită și gravă boală. Pandemiile și epidemiile de gripă acoperă până la 30-50% sau mai mult din populația lumii, provocând daune enorme sănătății și economiei țărilor. Primele descrieri ale epidemiilor de gripă datează din secolul 12-14. Apariția pandemiilor și a epidemiilor majore este cauzată de virusul gripal de tip A, care se datorează variabilității ridicate a virusului și este asociat cu apariția unui nou subtip ca urmare a schimbării antigenului.

Între pandemii, focarele epidemice apar la fiecare 1,5-2 ani, care este asociată cu deriva antigenică a virușilor. În 1918, pandemia de gripă spaniolă (1,5 miliarde de oameni s-a îmbolnăvit, 20 de milioane au murit) a fost cauzată de virusul gripei A1, înregistrată în principal în Spania, această pandemie acoperind aproape întreaga populație a Pământului; boala s-a caracterizat prin dezvoltarea pneumoniei hemoragice extrem de severe cu o rată record de mortalitate (până la 1% din toate cazurile).

În 1957, pandemia „asiatică” (2 miliarde de oameni s-a îmbolnăvit) a fost cauzată de un nou subtip - subtipul A2. În 1968, pandemia „Hong Kong” (1 miliard de persoane s-a îmbolnăvit) a fost cauzată de un subtip nou apărut - subtipul A3. De regulă, o nouă variantă a virusului deplasează un soi circulant anterior din populația umană.

Dar în 1977, după un hiatus de 20 de ani, tipul A1 s-a „întors brusc”, ducând la o epidemie majoră. În consecință, variantele deplasate ale virusului gripal persistă și la anumite intervale pot provoca din nou o epidemie. Virusul de tip B provoacă epidemii locale, iar tipul C nu provoacă epidemii. Patogenia și tabloul clinic al bolii. Poarta de intrare este calea aeriană superioară. Virusul invadează celulele epiteliale ale membranei mucoase și se înmulțește în ele.

Efectul virusului asupra celulelor epiteliale provoacă necroza și descuamarea (respingerea) epiteliului, ca urmare a căreia membrana mucoasă devine permeabilă la viruși și bacterii. Acestea intră în fluxul sanguin și se răspândesc în tot corpul. ”Viremia este însoțită de leziuni multiple ale endoteliului capilar, cu o creștere a permeabilității lor.

În cazurile severe, există hemoragii extinse în plămâni, miocard, organe parenchimatoase. Produsele de degradare ale celulelor deteriorate și ale proteinelor virale au un efect toxic asupra diferitelor organe și sisteme de organe. Toxinele virusului inhibă puternic sistemul nervos central și, deși procesul nu durează mult (3-5 zile), persoana bolnavă rămâne slăbită mult timp, iar o anumită infecție secundară se alătură corpului slăbit și apar complicații: gripă pneumonie, edem pulmonar acut, afectarea rinichilor, inimii, bronhiilor.

O complicație obișnuită a gripei este pneumonia bacteriană (streptococi din grupul B). În timpul pandemiei de gripă spaniolă, oamenii au murit în principal din cauza pneumoniei bacteriene secundare.

În patogeneza gripei, nu numai intoxicația este importantă, ci și alergizarea, precum și o încălcare a proprietăților funcționale ale celulelor imune competente odată cu dezvoltarea imunodeficienței. Perioadă de incubație- câteva ore - 1-3 zile. Caracterizată printr-un debut acut, o creștere a temperaturii la 37,5 - 38 ° C, intoxicație generală, exprimată în stare de rău, cefalee, durere în globii oculari, procese inflamatorii ale tractului respirator de severitate variabilă (rinită, laringită, traheită, faringită).

Febra cu gripă fără complicații durează 5-6 zile. Imunitate. După boala transferată, se formează imunitate specifică tipului și imunității specifice tulpinii, care este asigurată de factori celulari și umorali specifici și nespecifici. Anticorpii Ig A au o mare importanță. Imunitatea încrucișată nu se dezvoltă, după ce ați transferat gripa de tip A1, vă puteți îmbolnăvi de gripa de tip A2 etc. După virusul de tip, imunitatea este de 1-2 ani, după virusul de tip B - 3-5 ani.

Imunitate naturală pasivă - la copii sub 8 - 11 luni. Datorită variabilității antigenice ridicate a virusului, recuperarea nu duce la dezvoltarea rezistenței persistente la infecții repetate.

Diagnostic de laborator. Material de testare: frotiuri-amprente din membrana mucoasă a cavității nazale, descărcarea nazofaringelui, bucăți de plămâni, creier în caz de deces.

Metode de diagnostic: 1) metoda citorinoscopiei - detectarea incluziunilor intracelulare specifice virusului - atunci când sunt colorate cu pioctanină la microscop, sunt vizibile incluziunile roșu aprins ale virusului gripal în celulele epiteliului ciliar; 2) metoda virologică - izolarea virusului gripal din corpul uman prin infectarea embrionilor de pui prin spălarea din nazofaringe a pacientului; indicarea (prezența) virusului se efectuează cu ajutorul RHA (virusurile gripale aglutinează eritrocitele oamenilor și ale diferitelor animale), identificarea virusului se efectuează în etape: tipul este determinat în RSC, subtipul hemaglutininei - în RTGA, și subtipul neuraminidazei - în reacția de inhibare a activității enzimatice; 3) metoda serologică - detectarea unei creșteri a titrului (de 4 ori) a anticorpilor specifici în serul pacientului folosind RSK, RTGA, PH în cultura celulară, reacția de precipitare în gel, ELISA; 4) metodă biologică - infecție intranazală a șoarecilor - introducerea materialului în plămâni sub anestezie eterică; șoarecii mor după 2 până la 3 zile ca urmare a pneumoniei; 5) diagnostic rapid - detectarea antigenului viral utilizând RIF.

Tratament și prevenire.

Pentru prevenirea și tratamentul în primele zile ale bolii, se utilizează interferon leucocitar uman (intranazal). V scopuri medicinale utilizare medicamente antivirale- remantadină (gripă tip A), adapromină, virazol și medicamente imunomodulatoare - dibazol, prodigiosan, levomizol.

În gripa severă, în special la copii, se folosește imunoglobulina anti-gripală a donatorului, precum și medicamentele - inhibitori ai proteazelor celulare (gordox, contrikal, acid aminocaproic).

Profilaxie specială. Se utilizează următoarele medicamente antivirale și imunomodulatoare, precum și vaccinuri - vii și inactivate: 1) monovaccinuri vii pentru administrare orală - tulpini atenuate de viruși care circulă în prezent (A1, A3 și B); prezintă cea mai mare imunogenitate; 2) vaccinuri virionale întregi din tulpini virulente inactivate de formaldehidă sau raze UV; 3) vaccinuri antigripale subunitare numai din antigene de suprafață - antigene HA și NA (au o reactogenitate minimă).

Pentru a obține vaccinuri, virusurile sunt cultivate în embrioni de pui și într-o cultură celulară de embrioni de pui.

Odată cu introducerea vaccinurilor, se formează imunitate locală și umorală. Vaccinarea se efectuează în perioadele cu cel mai mare risc de epidemii. Este indicat mai ales pentru tineri și bătrâni. Utilizarea vaccinurilor ucise necesită o revaccinare anuală; eficiența lor nu depășește 60 - 70%.

pentru că Deoarece variațiile antigenice ale agentului patogen sunt adesea observate, setul de antigeni ai virusului corespunzător pentru imunizare poate fi determinat numai după debutul unui focar.

Biletul 15.

Reacția de hemaglutinare (RHA).

În laborator, ei folosesc două reacții de hemaglutinare care sunt diferite în mecanismul de acțiune.

Primul RHA este serologic. În această reacție, celulele roșii din sânge se aglutinează atunci când interacționează cu anticorpii corespunzători (hemaglutinine).

Reacția este utilizată pe scară largă pentru a determina grupele de sânge.

Al doilea RHA nu este serologic. În ea, aderența eritrocitelor nu este cauzată

anticorpi și substanțe speciale formate de viruși. De exemplu, virusul gripal aglutină eritrocitele găinilor și cobaiilor, virusul poliomielitei - eritrocitele oilor. Această reacție face posibilă evaluarea prezenței unui anumit virus în materialul testat.

Reacția se efectuează în eprubete sau pe plăci speciale cu găuri.

Materialul care trebuie testat pentru prezența virusului este diluat cu o soluție izotonică de la 1:10 la 1: 1280; 0,5 ml din fiecare diluție se amestecă cu un volum egal de 1-2% suspensie de eritrocite. La control, 0,5 ml de eritrocite se amestecă cu 0,5 ml de soluție izotonică. Tuburile sunt plasate într-un termostat timp de 30 de minute, iar plăcile sunt lăsate la temperatura camerei timp de 45 de minute.

Contabilitatea rezultatelor. La rezultat pozitiv reacție la fundul eprubetei sau sondei, cade un precipitat de eritrocite cu margini festonate („umbrelă”), acoperind întregul fund al sondei.

Reacția de inhibare a hemaglutinării

Dacă rezultatul este negativ, eritrocitele formează un sediment dens cu margini netede („buton”). Același sediment ar trebui să fie controlat.

Intensitatea reacției este exprimată prin semne „+”. Titrul virusului este diluarea maximă a materialului în care are loc aglutinarea.

Reacția de inhibare a hemaglutinării

Aceasta este o reacție serologică în care anticorpii antivirali specifici, care interacționează cu un virus (antigen), îl neutralizează și îl privează de capacitatea de a aglutina eritrocitele, adică

Adică inhibă reacția de hemaglutinare. Această reacție vă permite să determinați tipul și tipul de viruși.

Declarația reacției. 0,25 ml de ser antiviral se amestecă cu un volum egal de material care conține virusul. Amestecul este agitat și plasat într-un termostat timp de 30 de minute, după care se adaugă 0,5 ml'1-2% suspensie de eritrocite.

Contabilitatea rezultatelor. Odată cu setarea corectă a experimentului în controlul serului și eritrocitelor, ar trebui format un "buton" - nu există niciun factor care să aglutineze eritrocitele; în controlul antigenului, se formează o „umbrelă” - virusul a provocat aglutinarea eritrocitelor.

Dacă serul este omolog cu virusul studiat, se formează un „buton” - serul a neutralizat virusul.

Reacție indirectă de hemaglutinare

Reacția de hemaglutinare indirectă (pasivă) (RIGA) se bazează pe faptul că eritrocitele, dacă un antigen solubil este adsorbit pe suprafața lor, capătă capacitatea de aglutinare atunci când interacționează cu anticorpii antigenului adsorbit.

Declarația reacției.

Serul este încălzit 30 de minute la 56 ° C, diluat secvențial într-un raport de 1:10 - 1: 1280 și turnat în tuburi sau godeuri de 0,25 ml, unde apoi se adaugă 2 picături de eritrocite cu antigeni adsorbiți pe ele.

Controale: o suspensie de eritrocite cu antigene adsorbite pe ele cu ser evident imun, o suspensie de eritrocite cu antigene adsorbite pe ele cu ser normal; suspendarea eritrocitelor normale cu serul testat.

În primul control, aglutinarea ar trebui să aibă loc, în al doilea și al treilea, nu ar trebui să fie.

Întrebări de control.

1. Ce indică un rezultat RHA pozitiv între eritrocite și materialul testat pentru prezența virusului?

2. Va apărea reacția de aglutinare a eritrocitelor dacă li se adaugă virusul și serul corespunzător?

Care este numele reacției care dezvăluie acest fenomen?

LUCRARE PRACTICĂ Nr. 12.

Reacție de legare a complementului.

Reacția de legare a complimentului (CSC) se bazează pe faptul că un complex specific antigen-anticorp adsorbe întotdeauna (leagă) complementul de la sine.

Această reacție este utilizată pe scară largă în identificarea antigenelor și în serodiagnosticul infecțiilor, în special a bolilor cauzate de spirochete (reacția Wasserman), rickettsia și viruși.

Reacție serologică complexă RCC.

Acesta implică complement și două sisteme antigen-anticorp. În esență, acestea sunt două reacții serologice.

Sistemul potrivit - cel principal - constă dintr-un antigen și un anticorp (unul este cunoscut, celălalt nu). I se adaugă o anumită cantitate de complement. Când antigenul și anticorpii acestui sistem se potrivesc, aceștia vor combina și lega complimentul. Complexul format este fin dispersat și nu este vizibil.

Formarea acestui complex este recunoscută cu ajutorul unui al doilea sistem hemolitic sau indicator.

Include eritrocite de oaie (antigen) și serul hemolitic corespunzător (anticorp), adică complex imunitar gata preparat. În acest sistem, liza globulelor roșii poate apărea numai în prezența complementului. Dacă complementul este legat de primul sistem, atunci nu va exista hemoliză în al doilea sistem;

fără complement gratuit. Absența hemolizei (conținutul tubului este tulbure sau la baza sedimentului său de eritrocite) este înregistrată ca rezultat pozitiv al CSC.

Dacă în primul sistem antigenul nu corespunde anticorpului, atunci complexul imunitar nu este format și complimentul va rămâne liber. Rămânând liber, complimentul participă la al doilea sistem, provocând hemoliză, rezultatul CSC este negativ (conținutul tuburilor este „sânge lac” transparent).

Componente, reacții de legare complementare:

Antigen - de obicei lizat, extract, hapten,

mai rar o suspensie de microorganisme.

2. Anticorp - serul pacientului.

3. Complement - ser cobai.

Antigen - eritrocite ovine.

5. Anticorp - hemolizină la eritrocitele de oaie.

6. Soluție izotonică.

Datorită faptului că un număr mare de componente complexe sunt implicate în DGC,

acestea trebuie pre-titrate și luate în reacție în cantități exacte și în volume egale: 0,5 sau 0,25 fiecare, mai rar 0,2.1,25 sau 1,0 ml (volumele mari dau un rezultat mai precis). Titrarea componentelor de reacție se efectuează în același volum ca și experimentul, înlocuind ingredientele lipsă cu o soluție izotonică.

Informații similare:

Căutați pe site:

Se bazează pe faptul că eritrocitele, pe care antigenii sunt adsorbiți anterior, capătă capacitatea de aglutinare în prezența serurilor omoloage (anticorpi).

În acest caz, eritrocitele acționează ca purtători cu determinanți specifici, a căror aglutinare are loc ca urmare a reacției antigen + anticorp.

Eritrocitele, la suprafața cărora antigenii sunt ferm atașați, se numesc diagnostic antigenic eritrocitar sau eritrocite sensibilizate cu un antigen.

Un alt tip de anticorpi RNGA sunt adsorbiți pe suprafața eritrocitelor și aglutinarea lor ulterioară are loc în prezența unui antigen omolog.

În acest caz, astfel de eritrocite se numesc anticorpi eritrocitari diagnosticum sau eritrocite sensibilizate cu anticorpi.

Pe baza acestor două abordări metodologice fundamentale, au fost dezvoltate și utilizate multe modificări ale RNGA. Astfel, particulele mici de latex standard sunt utilizate ca purtători.

Reacția de inhibare a hemaglutinării (RTGA)

În acest caz, reacția se numește reacție de aglutinare cu latex (RLA) sau se folosește Staphylococcus aureus - reacția de coaglutinare etc. De obicei, diagnosticul eritrocitar este pregătit la întreprinderile din industria biologică, iar în laboratoarele de diagnostic deja pun principalele experiența RNGA.

Pregătirea diagnosticului eritrocitar include următorii pași:

fixarea eritrocitelor cu formaldehidă sau glutaral, sau aldehide acrilice.
Astfel de eritrocite prelucrate persistă mult timp. Cel mai adesea, în acest scop se utilizează eritrocite de berbec, oameni, pui etc.
tratamentul eritrocitelor fixe cu soluție de tanin. Ca urmare, eritrocitele dobândesc proprietatea de a adsorbi ireversibil proteinele (viruși și anticorpi) pe suprafața lor;
sensibilizarea eritrocitelor bronzate cu viruși sau anticorpi.

Trebuie remarcat faptul că metodele de pregătire a diagnosticului eritrocitar pentru infecțiile virale sunt diferite.

Tehnica pentru setarea RNGA pentru detectarea și determinarea titrului anticorpului este următoarea:

se adaugă doze egale de eritrocite sensibilizate la antigen la diluțiile serice de 2 ori ale serului;
amestecul se lasă 2-3 ore la temperatura camerei sau 16-18 ore la 4 ° C;
ia în considerare rezultatele.
Dacă serul conține anticorpi împotriva virusului, care sensibilizează eritrocitele, se observă hemaglutinare, care este evaluată în cruci.

Pentru titrul anticorpilor din ser, se ia cea mai mare diluție a serului, care asigură în continuare hemaglutinare cu cel puțin două încrucișări.

RNGA este însoțit de toate controalele relevante. De obicei, reacția se efectuează prin micrometodă.

RNGA vă permite să rezolvați următoarele sarcini de diagnostic:

detectează anticorpii și determină titrul acestora în serul sanguin folosind un diagnostic antigenic eritrocitar cunoscut;
detectează și identifică un virus necunoscut folosind un anticorp eritrocitar diagnosticum cunoscut.

Avantajele RNGA: sensibilitate ridicată, simplitate a tehnicii de setare și răspuns rapid.

Cu toate acestea, este important de reținut că există mari dificultăți în pregătirea diagnosticului stabil al eritrocitelor (dependență mare de puritatea componentelor utilizate, necesitatea de a selecta un mod de fixare, bronzarea și sensibilizarea eritrocitelor pentru fiecare tip de virus).

Dacă găsiți o eroare, selectați o bucată de text și apăsați Ctrl + Enter.

În contact cu

colegi de clasa

Folosește eritrocite sau materiale sintetice neutre (de exemplu, particule de latex), pe suprafața cărora sunt absorbite antigeni (bacterieni, virali, tisulari) sau anticorpi.

Aglutinarea lor are loc atunci când se adaugă serurile sau antigenele corespunzătoare. Eritrocitele sensibilizate cu antigene sunt numite antigenice eritrocitare diagnostice și sunt utilizate pentru detectarea și titrarea anticorpilor. Eritrocite sensibilizate la anticorpi. se numesc diagnostici imunoglobulini eritrocitari și sunt folosiți pentru detectarea antigenelor.

Reacția de hemaglutinare pasivă este utilizată pentru diagnosticarea bolilor cauzate de bacterii (febra tifoidă și paratifoidă, dizenteria, bruceloză, ciumă, holera etc.), protozoare (malarie) și virusuri (gripă, infecții cu adenovirus, hepatita virala B, rujeolă, encefalită transmisă de căpușe, febră hemoragică din Crimeea etc.), precum și pentru determinarea unor hormoni, pentru a identifica hipersensibilitatea pacientului la medicamente și hormoni, precum penicilina și insulina.

Reacție de hemaglutinare pasivă (RPHA).

Reacția de hemaglutinare pasivă este o metodă sensibilă de diagnostic serologic și este utilizată atât pentru diagnosticarea precoce, cât și pentru cea retrospectivă, precum și pentru determinarea stării imunopogice a celor vaccinați. La pacienții cu tularemie, anticorpii sunt de obicei detectați la sfârșitul primei sau a 2-a săptămâni a bolii, după 1-1,5 luni titrurile RPHA ating valorile maxime (1: 100000-1: 20.000, mai rar mai mari), după pe care le scad la nivelul 1: 100-1: 200 sunt stocate mult timp.

La vaccinați, anticorpii sunt, de asemenea, detectați în mod constant, cu toate acestea, în titruri mai mici, care nu depășesc 1: 2000-1: 5000 1-1,5 luni după vaccinare, rămân câțiva ani la un nivel scăzut de 1: 20-1: 80.

Tularemia erythrocyte diagnosticum (antigenic) este utilizat ca antigen pentru stabilirea RPHA.

Medicamentul este un eritrocit de oaie formalizat sensibilizat cu antigen tularemic, disponibil sub formă lichidă și uscată. Preparat lichid - 10% suspensie de eritrocite într-o soluție de formalină cu concentrație de 10%. Preparat liofilizat uscat - suspensie de eritrocite 10% uscată sub vid fără conservant. Înainte de utilizare, se diluează conform instrucțiunilor de pe etichetă. Pentru stabilirea reacției în plăci de polistiren, ambele medicamente sunt utilizate în concentrație de 2,5%, iar la stabilirea reacției în microvolume - în concentrație de 0,5%.

Tehnica pentru organizarea RPGA.

Serurile testate sunt diluate cu soluție fiziologică 1: 5 (1:10) și încălzite la 56 ° C timp de 30 de minute.

Reacția de hemaglutinare (RHA) și

După aceea, pentru a îndepărta anticorpii eterogeni împotriva eritrocitelor de miel, serurile sunt tratate cu o suspensie de 50% de eritrocite de miel formalizate. Pentru aceasta, se adaugă eritrocite la o rată de 2 picături (0,05 ml fiecare) la 1 ml de ser și se amestecă bine prin agitare.

Serul este lăsat până când eritrocitele s-au instalat complet sau centrifugat după o oră la temperatura camerei, după care este gata pentru cercetare.

Lichidul de diluare este turnat într-un volum de 0,5 ml într-un rând de godeuri ale unei plăci de polistiren.

Într-un studiu preliminar al serurilor, este recomandabil să le testați prin stabilirea reacției într-un rând scurt al plăcii (6 godeuri). Dacă anticorpii sunt detectați într-un rând scurt, serurile sunt retestate într-un rând lung de diluare (12 godeuri).

După vărsarea lichidului de diluare, adăugați 0,5 ml de ser de testat la o diluție de 1: 5 în primul godeu al fiecărui rând (scurt sau lung). Apoi, în aceleași volume de ser, se titrează cu diluții de două ori. Astfel, diluțiile serice sunt obținute în seria scurtă de la 1:10 la 1: 320 și în seria lungă de la 1:10 la 1: 20480. După titrarea serurilor, o picătură (0,05 ml) dintr-o suspensie funcțională de 2,5% de eritrocite sensibilizate este adăugată la fiecare godeu.

Conținutul plăcilor este bine agitat până se obține o suspensie omogenă. Plăcile sunt lăsate la temperatura camerei pe o suprafață staționară a mesei. O înregistrare preliminară a reacției se efectuează după 2-3 ore, determinarea finală a titrului se efectuează după sedimentarea completă a eritrocitelor din puțuri. Următoarele controale sunt furnizate pentru reacție: 1) serul testat la o diluție de 1:10 într-un volum de 0,5 ml + 1 picătură de 2,5% suspensie de eritrocite nesensibilizate; 2) lichid de diluare într-un volum de 0,5 ml + 1 picătură de 2,5% suspensie de eritrocite nesensibilizate; 3) lichid de diluare într-un volum de 0,5 ml + 1 picătură de 2,5% suspensie de eritrocite sensibilizate.

Toate controalele ar trebui să fie în mod clar negative.

Contabilitate și evaluare a RPGA. Reacția este evaluată conform următoarei scheme:

1) o reacție puternic pozitivă (++++) - eritrocitele cad pe fundul găurii într-un strat uniform sub forma unei „umbrele”, care are deseori margini asfaltate;

2) reacție pozitivă (+++) - globulele roșii acoperă cel puțin 2/3 din fundul puțului;

3) o reacție slab pozitivă (++) - aglutinatul este mic și este situat chiar în centrul găurii;

4) o reacție dubioasă (+) - există granule separate de aglutinat în jurul sedimentului eritrocitar chiar în centrul găurii;

5) negativ (-) - în partea de jos a găurii, eritrocitele se așează sub forma unui "buton" sau a unui inel mic, cu margini netede, clar definite.

Titrul seric este luat în considerare în funcție de ultima diluție a serului, care a dat o reacție destul de clară (cel puțin trei plusuri).

O diluție de 1: 100 și mai mare este considerată un titru de diagnostic, totuși, ca și în cazul RA, este necesar să se monitorizeze creșterea acesteia.

RPHA în tularemie este destul de specific și prezintă unele reacții încrucișate numai cu seruri de bruceloză. Diagnostic diferentiat posibil prin înălțimea titrilor în RPHA, care sunt semnificativ mai mari cu un antigen omolog.

Tehnică pentru setarea RPGA în microvolume.

RPHA poate fi efectuat în microvolume utilizând un microtitrare de tip Takachi (sau plăci de microtitrare cu fund rotund cu micropipete), care permite titrarea materialului în volume de 25 μl și 50 μl. Tehnica de configurare a reacțiilor, succesiunea tuturor operațiilor este aceeași ca și în studiul pe plăci de polistiren. Cu toate acestea, trebuie avut în vedere faptul că sensibilitatea micrometodei este de obicei o singură diluție (adică

De 2 ori) mai mic decât metoda macro.

Pentru a seta reacția într-un microtitrare, un lichid de diluare într-un volum de 50 μl este introdus în fiecare godeu folosind o pipetă picurătoare. Apoi, folosind titratori cu un cap de 50 μl, serul de testare este luat prin scufundarea capului în el.

Asigurați-vă că lichidul a umplut capul titratorului. Transferați titratorul cu ser în primul puț și, ținându-l în poziție verticală, efectuați mai multe mișcări de rotație în ambele direcții. Apoi titratorul este transferat în fântâna următoare și manipularea se repetă. Titrarea poate fi efectuată simultan în mai multe rânduri. După titrarea întregului rând, titratorul este spălat cu apă distilată (cu o schimbare de 2 porții) prin mișcări rotative, apa este îndepărtată din cap folosind un tampon și arsă pe flacăra arzătorului.

După titrare, adăugați 25 μl de diagnostic eritrocitar în godeuri.

Concentrația diagnosticului pentru RPHA în microvolume trebuie să fie de 0,5% (adică 2,5% suspensie de eritrocite se diluează suplimentar de 5 ori). După adăugarea eritrocitelor, plăcile trebuie agitate ușor până se obține o suspensie omogenă. Rezultatele pot fi înregistrate în decurs de 1-1,5 ore, ceea ce reprezintă un avantaj semnificativ al RPHA într-un microtitrare.

În plus, această tehnică necesită o cantitate mică din toate ingredientele de reacție și serurile de testat.

Reacția este luată în considerare în conformitate cu următoarea schemă:

1) „+” - hemaglutinare cu drepturi depline, în care eritrocitele cad pe fundul găurii într-un strat uniform sub forma unei „umbrele” care ocupă cel puțin 2/3 din fund;

2) "+ -" - hemaglutinare parțială, în care eritrocitele cad în fund sub forma unui inel liber de dimensiuni mici;

3) "-" - absența hemaglutinării, atunci când eritrocitele cad în partea de jos sub forma unui buton mic sau a unui inel cu margine uniformă.

Specificitatea unui rezultat pozitiv obținut în RPHA poate fi verificată folosind o reacție cu trei componente - reacție de inhibare a hemaglutinării pasive (RPHA).

Tehnică pentru organizarea RTPGA.

Această reacție este utilizată pentru a confirma specificitatea unui rezultat RPHA pozitiv atunci când este discutabil sau cu un interes epidemiologic deosebit. Mecanismul de reacție constă într-o inhibare specifică a hemaglutinării atunci când se adaugă la serul de testare o suspensie de bacterii tularemice ucise. Trei componente interacționează în reacție: serul testat, antigenul tularemiei specifice și diagnosticul eritrocitar antigenic RTPHA sunt plasate de obicei într-un rând de 7-8 godeuri.

Este recomandabil să instalați un al doilea RPGA în paralel cu RTPHA. 0,25 ml de lichid de diluare se toarnă în două rânduri de godeuri, apoi serul testat într-un volum de 0,25 ml se adaugă la primele godeuri din ambele rânduri și se titrează. Se obțin două serii identice de diluții serice. Adăugați 0,25 ml lichid de diluare la toate godeurile din al doilea rând și 0,25 ml suspensie de bacterii tularemice la godeurile din primul rând.

Se utilizează Tularemia diagnosticum (care conține 25 de miliarde de bacterii tularemice în 1 ml), diluată anterior de 50 de ori.

Această suspensie conține 500 de milioane de bacterii în 1 ml sau 125 de milioane într-un volum de 0,25 ml. După adăugarea antigenului, placa este lăsată 1 oră la temperatura camerei, după care se adaugă o picătură (0,05 ml) de diagnostic eritrocitar la toate godeurile de pe ambele rânduri, placa este agitată și lăsată pe o suprafață plană a mesei.

Contabilitatea se efectuează în 2-3 ore.

Contabilitate și evaluare a RTPHA. Dacă serul de testare conține anticorpi specifici tularemiei, aceștia sunt neutralizați de antigenul adăugat și hemaglutinarea nu va avea loc în primul rând de godeuri sau, cu un titru seric ridicat, hemaglutinarea va fi notată într-un număr mai mic (cu 2-4) de fântâni decât în rând cu RPHA. În acest caz, specificitatea rezultatelor este confirmată.

Dacă se observă hemaglutinare în ambele rânduri, adică rezultatele RTPHA și RPHA coincid, aceasta indică absența anticorpilor tularemici în serul testat. În acest caz, rezultatul primar al RPHA este recunoscut ca nespecific.

Tehnică pentru setarea RTPGA în microvolume. RTPHA, precum și RPHA, pot fi efectuate în microvolume utilizând un microtitrare de tip Takachi.

Pentru a face acest lucru, 0,25 μl de lichid diluat este introdus în godeurile microplăcilor în două rânduri de câte 7-8 godeuri fiecare. Apoi, folosind un titrator, se notează 0,25 μl din serul de testare și se titrează în ambele rânduri. După aceea, 25 μl de antigen tularemie (a cărui concentrație este de 500 de milioane de bacterii tularemice în 1 ml) se adaugă la fiecare godeu din primul rând și se adaugă 25 μl de lichid de diluare în al doilea rând.

Plăcile sunt lăsate timp de 1 oră la temperatura camerei, după care se adaugă 25 μl de spectrocit antigenic diagnostic (concentrație de 0,5%) la toate godeurile de pe ambele rânduri.

Rezultatele sunt luate în considerare și evaluate într-un mod similar cu reacția în macro-volume.

Data publicării: 03-02-2015; Citiți: 3176 | Încălcarea drepturilor de autor ale paginii

studopedia.org - Studopedia.Org - 2014-2018. (0,003 s) ...

Subtipurile de virus A cu antigene H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 și altele pot fi diferențiate în RTGA cu un set de seruri omogene de tip specific.

Reacție de legare a complementului. Mecanism. Componente. Cerere

Reacția de legare a complementului (CSC) este că atunci când antigenele și anticorpii se corespund, formează un complex imunitar, la care complementul (C) este atașat prin fragmentul Fc al anticorpilor, adică complementul este legat de un antigen-anticorp. complex. Dacă complexul antigen-anticorp nu este format, atunci complementul rămâne liber.

Interacțiunea specifică dintre AG și AT este însoțită de adsorbție (legare) a complementului. Deoarece procesul de legare a complementului nu se manifestă vizual, J. Bordet și O. Zhangu au sugerat utilizarea sistemului hemolitic (eritrocite de oaie + ser hemolitic) ca indicator, care arată dacă complementul este fixat de complexul AG-AT. Dacă AG și AT corespund reciproc, adică se formează un complex imunitar, atunci complementul este legat de acest complex și nu apare hemoliza. Dacă AT nu corespunde cu AG, atunci complexul nu este format și complementul, în timp ce rămâne liber, se conectează cu al doilea sistem și provoacă hemoliză.

Componente. Testul de fixare a complementului (CSC) este o reacție serologică complexă. Pentru implementarea sa, sunt necesare 5 ingrediente, și anume: AG, AT și complement (primul sistem), eritrocite de oaie și ser hemolitic (al doilea sistem).

Antigenul pentru CSC poate fi culturi de diferite microorganisme ucise, lizatele lor, componente ale bacteriilor, organe modificate patologic și organe normale, lipide tisulare, viruși și materiale care conțin viruși.

Serul de cobai proaspăt sau uscat este folosit ca supliment.

Mecanism. RSK se efectuează în două faze: prima fază - incubarea unui amestec care conține trei componente antigen + anticorp + complement; A doua fază (indicator) - detectarea complementului liber în amestec prin adăugarea la acesta a unui sistem hemolitic format din eritrocite de oaie și ser hemolitic care conține anticorpi împotriva acestora. În prima fază a reacției, când se formează complexul antigen-anticorp, complementul este legat de acesta și apoi în a doua fază nu va apărea hemoliza eritrocitelor sensibilizate de anticorpi; reacția este pozitivă. Dacă antigenul și anticorpul nu corespund între ele (nu există antigen sau anticorp în proba testată), complementul rămâne liber și în faza a 2-a se va alătura complexului anticorp eritrocit-anti-eritrocit, provocând hemoliză; reacția este negativă.

Cerere. RSK este utilizat pentru a diagnostica multe boli infecțioase, în special sifilisul (reacția Wasserman).

№ 83 Imunoanaliză enzimatică, imunoblotare. Mecanism, componente, aplicare.
Test imunosorbent legat sau o metodă - detectarea antigenelor folosind anticorpii lor corespunzători conjugați cu o enzimă tag (peroxidază de hrean, beta-galactozidază sau fosfatază alcalină). După combinarea antigenului cu serul imun marcat cu enzime, substratul / cromogenul se adaugă la amestec. Substratul este scindat de enzimă și culoarea produsului de reacție se schimbă - intensitatea culorii este direct proporțională cu numărul de molecule de antigen și anticorp legate. Se folosește ELISA pentru diagnosticarea bolilor virale, bacteriene și parazitare, în special pentru diagnosticarea infecțiilor cu HIV, hepatitei B etc., precum și pentru determinarea hormonilor, enzimelor, medicamentelor și a altor substanțe biologic active conținute în materialul de testat în minor concentrații (10 10 -10 12 g / l).

ELISA în fază solidă- o variantă a testului, atunci când una dintre componentele răspunsului imun (antigen sau anticorp) este absorbită pe un purtător solid, de exemplu, în godeurile plăcilor de polistiren. Componentele sunt detectate prin adăugarea de anticorpi sau antigeni marcați. Dacă rezultatul este pozitiv, culoarea cromogenului se schimbă. De fiecare dată după adăugarea componentei următoare, reactivii nelegați sunt îndepărtați din puțuri prin spălare,

I. La determinarea anticorpilor (figura din stânga), serul sanguin al pacientului, serul antiglobulinic marcat cu enzimă și substratul / cromogenul enzimei sunt adăugate secvențial la godeurile plăcilor cu antigenul sorbit.

II. La determinarea antigenului (figura dreaptă), antigenul este introdus în puțuri cu anticorpi adsorbiți (de exemplu, serul de sânge cu antigenul dorit), serul de diagnosticare împotriva acestuia și anticorpii secundari (împotriva serului de diagnosticare) etichetați cu enzima sunt adăugat, apoi substratul / cromogenul pentru enzimă.

ELISA competitivă pentru determinarea antigenelor: antigenul țintă și antigenul marcat cu enzime concurează între ele pentru legarea unui număr limitat de anticorpi ai serului imun.

Un alt test este ELISA competitiv pentru determinarea anticorpilor: anticorpii țintă și anticorpii marcați enzimatic concurează între ei pentru antigenii adsorbiți pe faza solidă.

Imunoblotarea- o metodă extrem de sensibilă pentru detectarea proteinelor pe baza unei combinații de electroforeză și ELISA sau RIA. Imunoblotarea este utilizată ca metodă de diagnostic pentru infecția cu HIV etc.

Antigenii patogeni sunt separați prin electroforeză în gel de poliacrilamidă, apoi transferați din gel în hârtie activată sau membrană de nitroceluloză și dezvoltați utilizând ELISA. Firmele produc astfel de benzi șterse de antigen. Serul pacientului se aplică pe aceste benzi. . Apoi, după incubare, anticorpii nelegați ai pacientului sunt spălați și se aplică serul împotriva imunoglobulinelor umane marcate cu enzima . Complexul format pe bandă [antigen + anticorp pacient + anticorp împotriva Ig umană] este detectat prin adăugarea unui substrat cromogen care își schimbă culoarea sub acțiunea unei enzime.