Има много методи за качествено и количествено определяне на вирус-специфични антитела. Използвайки тези методи, е възможно да се открият едновременно IgM и IgG, и поотделно имуноглобулини от всеки клас. По правило в реакцията на свързване на комплемента се откриват само специфични за вируса IgGs. Въпреки това, когато се тестват микробиологични антигени по този метод, е възможно едновременно да се определят специфични IgM и IgG.

Имунологичните методи се използват главно за две цели: първо, за диагностициране на текуща, завършена или вродена вирусна инфекция и, второ, за откриване на специфични антитела, чието наличие показва минала инфекция и следователно имунитет към евентуална повторна инфекция. По отношение на силата на имунния отговор към вирусна инфекция, хората са много различни един от друг. На фиг. 3 показва типична крива на покачване на титъра

антитела в отговор на първична инфекция с рубеола. Лесно е да се види, че диагнозата рубеола е възможна чрез увеличаване на титъра на специфичен IgG и идентифициране на специфичен IgM. Наличието на специфичен IgM в кръвта на новородено показва вътрематочна инфекция, тъй като майчиният IgM, за разлика от IgG, се задържа от плацентата. Специфичният IgG от първична инфекция обикновено продължава през целия живот. Следователно наличието на антитела от този клас в кръвния серум показва имунитет към съответната повторна инфекция.

По -долу са представени имунологични методи за откриване на специфични антитела срещу вируса на рубеола, които са особено ефективни за диагностициране на фетално заболяване и определяне на титъра на специфични антитела в кръвния серум. Подробни описанияметодите, използвани за диагностициране на рубеола, могат да бъдат намерени в рецензии на Pattison и Morgan-Kapner.

Реакция на инхибиране на хемаглутинация

Вирусът на рубеола причинява хемаглутинация на червените кръвни клетки при много животински видове. Най-често в RTGA се използват еритроцити на еднодневни пилета. В тази реакция вирусът, отглеждан в култура и третиран с Tween 80 и етер, служи като хемаглутиниращ антиген на вируса на рубеола. Предварителната обработка увеличава титъра на НА на вируса.

5.1.1 Стандартизация на антиген на рубеола HA

1. 1 ml от 50% суспензия от пилешки еритроцити се промива три пъти във Veronal буфер с декстран и желатин чрез центрофугиране и ресуспендиране на утайката в 15-милиметрова епруветка с центрофуга. Измитите клетки се ресуспендират в DGV буфер за получаване на 30% суспензия.

Таблица 3. Приготвяне на веронален буфер с декстран и желатин

2. Разредете лиофилизирания препарат на НА-антиген на вируса на рубеола в необходимия обем дестилирана вода съгласно инструкциите.

3. Добавете 1 обем DGV към всеки от осемте гнезда на два съседни реда от 96-ямкова полистиролова микротитърна плоча с U-по-различни ямки.

4. В първите ямки на два реда се добавя един обем от НА антигена на вируса на рубеола.

5. Серийни двукратни разреждания на антиген на рубеола HA, вариращи от 1: 2 до 1: 256, се приготвят с помощта на 0,025 ml микротитър. Преди употреба главата на микротитратора трябва да се калцинира в горещо до пламък, след това да се охлади за няколко секунди, да се постави в дестилирана вода и да се попие с филтърна хартия.

6. Добавете по един допълнителен обем DGV-буфер към всяка от запълнените ямки. Като контрола, два обема DGV буфер се добавят към ямки 12 от първите два реда.

7. Суспензията от промити еритроцити на пилета се разрежда 100 пъти с DGV-буфер, като по този начин се получава 0,03% суспензия.

8. Във всички 18 ямки се добавят два обема от 0,03% суспензия на еритроцити, готовата плака се покрива с друга неизползвана плака и се инкубира за 1 час при 4 ° С.

9. На дъното на контролните ямки се образува плътна "плака" от неаглутинирани еритроцити. Аглутинираните еритроцити се утаяват равномерно. HA-титърът се счита за реципрочен на най-голямото разреждане на HA-антигена на вируса на рубеола, при което все още настъпва пълна аглутинация. Това разреждане съдържа 1 хемаглутинираща единица.

За тестване на серуми се използват 4 GA единици рубеолен антиген. По този начин, ако титърът на GA антиген е 32, тогава за откриване на антитела срещу вируса на рубеола, той се разрежда с DGV осем пъти. Разреденият антиген е стабилен за 25-48 часа при 4 ° С.

5.1.2 Предварителна обработка на суроватка

Всички серуми съдържат неспецифични инхибитори на хемаглутинацията, които трябва да бъдат отстранени. Неспецифичните GA инхибитори са предимно липопротеини, които се освобождават чрез третиране на серум с каолин. В допълнение, неспецифичните аглутинини на пилешки еритроцити могат да присъстват в човешките серуми. Въпреки това, предварителната адсорбция на тестваните серуми от еритроцити не е необходима, тъй като всички неспецифични хемаглутинини, присъстващи в серумите, се намират в контролите.

1. В стъклени епруветки с номера добавете 0,2 ml серум. Освен изследваните серуми, във всеки експеримент са необходими положителни и отрицателни контроли.

2. Добавете 0,8 ml 25% каолин в борат-физиологичен буфер във всяка епруветка.

3. Съдържанието на епруветките се разклаща и се оставя при стайна температура за 20 минути.

4. Отработеният каолин се утаява чрез центрофугиране в настолна центрофуга при 2000 об / мин за 20 минути.

5. Прехвърлете супернатантата в чисти, номерирани епруветки. В резултат на пречистването се получава серум, разреден четири пъти. Те се използват за формулиране на реакция на инхибиране на хемаглутинация. Sera може да се съхранява при 4 ° C за една нощ.

5.1.3 Инхибиране на реакцията на хемаглутинация

1. За да тествате една серумна проба, добавете един обем DGV към един ред ямки.

2. Добавете един обем серум, разреден четири пъти към първата и последната ямка.

3. Използвайки микротитър, пригответе последователни двукратни разреждания на серума.

4. Един обем рубеола GA-антиген, съдържащ 4 GAU, се добавя към ямки 1-10. Рубела GA антиген не се добавя към ямка 12.

5. В ямки 1-8 на друга плака се добавя един обем от работното разреждане на антигена на рубеола НА и след това в осем ямки се приготвят последователни двукратни разреждания на антигена НА. Един обем DGV се добавя към тези 16 ямки. Това титруване е тест за антиген на рубеола HA. За контрол, два обема DGV се добавят към кладенци 12 от първия и втория ред.

6. Покритите плочи се оставят за 1 час при стайна температура или за една нощ при 4 ° С.

7. Във всички напълнени ямки се добавят два обема от 0,03% суспензия на пилешки еритроцити и плочите се оставят за 1 - 1,5 часа при 4 ° С.

8. Преглеждайки плаките, определете титъра на антиген на рубеола НА. В контролните кладенци не трябва да се получава аглутинация.

9. Ако серумните аглутинирани еритроцити в отсъствието на рубеола GA антиген, е необходимо да се тества първоначалното разреждане на серума. Преди това серумът се адсорбира с една капка 30% суспензия от пилешки еритроцити за 1 час при стайна температура и след това еритроцитите се утаяват чрез центрофугиране.

10. Титърът на специфични антитела в изследвания серум се счита за реципрочен на разреждането, при което хемаглутинацията е напълно потисната.

5.1.4 Тълкуване на резултатите

При нисък титър е трудно да се интерпретират резултатите, тъй като при малко разреждане е възможно остатъчното присъствие на неспецифични инхибитори. Наличието на вирус-специфични антитела се счита за доказано при титър 16 или по-висок.

Реакцията на инхибиране на хемаглутинацията (RTGA) е метод за идентифициране на вирус или откриване на антивирусни антитела в кръвния серум на пациента, базиран на явлението отсъствие на аглутинация на еритроцитите от лекарство, съдържащо вирус в присъствието на имунен към него серум.

Много вируси имат способността да аглутинират еритроцитите на строго определени видове бозайници и птици. И така, вирусите на грип и паротит аглутинират еритроцитите на пилета, морски свинчета, човешки и аденовируси - еритроцити на плъхове и мишки. В тази връзка, за тяхното откриване в материала на пациенти или в култури от клетки, ембриони и животни, се задава реакцията на хемаглутинация (RHA). За тази цел в ямките на плаките се приготвят двойно увеличаващи се разреждания на ваксинирани материали и течности, като към тях се добавят еритроцитни суспензии на NaCl, измити с изотоничен разтвор. За да се контролира спонтанната аглутинация, еритроцитите се смесват с равен обем изотоничен разтвор на NaCl. Смесите се инкубират в термостат при 37 ° С или при стайна температура.

Резултатите от RGA се вземат предвид от естеството на аглутинация на еритроцитите след 30-60 минути, когато те обикновено се утаяват напълно в контролата. Положителните реакции са обозначени с плюсове. "++++" - утайка под формата на "чадър", "+++" - утайка с пролуки, "++" - утайка с големи пролуки, "+" - флокулентна утайка, заобиколена от зона от смачкани еритроцити , и " -" - същата рязко очертана утайка от еритроцити под формата на "бутон", както при контролата.

Като специфичен за групата, RHA не прави възможно определянето на видовете, принадлежащи на вирусите. Те се идентифицират с помощта на реакцията на инхибиране на хемаглутинацията (HAI). За настройката му се използват известни имунни антивирусни серуми, които се разреждат в изотоничен разтвор на натриев хлорид в двойно намаляващи концентрации и се изсипват в ямките. Равно количество ваксинирана течност се добавя към всяко от техните разреждания. Контролът е суспензия на вируса в изотоничен разтвор на натриев хлорид. Плаките със смес от серуми и вируси се държат в термостат за 30 минути или при стайна температура за 2 часа, след което към всеки от тях се добавя суспензия от еритроцити. След 30 минути се определя титърът на неутрализиращия серум (т.е. максималното му разреждане), който е причинил забавяне на аглутинацията на еритроцитите.

RTGA се използва при серологична диагностика на вирусни заболявания, по -специално грипни и аденовирусни инфекции. По -добре е да го поставите по същия начин като PH, със сдвоени серуми. Четирикратно увеличение на титъра на антителата във втория серум потвърждава предполагаемата диагноза.

Реакцията на инхибиране на хемаглутинацията (RTGA) се основава на блокада, потискане на вирусни антигени от антитела на имунния серум, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират еритроцитите.

RTGA се използва за диагностициране на много вирусни заболявания, чиито причинители (грип, морбили, рубеола, вируси на енцефалит, пренасян от кърлежи и др.) Могат да аглутинират еритроцитите на различни животни.

Механизъм. Типизирането на вируса се извършва в реакцията на инхибиране на хемаглутинацията (RTGA) с набор от специфични за типа серуми. Резултатите от реакцията се вземат предвид при липса на хемаглутинация. Вирус А подтипове с антигени H 0 N 1, H 1 N 1, H 2 N 2, H 3 N 2 и т.н. могат да бъдат диференцирани в RTGA с набор от хомоложни типоспецифични серуми.

Напоследък реакцията се използва широко в лаборатории по клинична вирусология за определяне на титрите на специфични антитела към определени вируси, както и за серологична идентификация и типизиране на вирусни изолати от клиничен материал от пациенти. Използват се донякъде ограничено поради наличието в кръвния серум на хора на неспецифични инхибитори на вируси, както и естествени антитела - аглутинини.

Принцип на RTGAсе състои в смесване на равни обеми кръвен серум и суспензия на вируса в епруветка, а след експозиция се определя дали вирусът се запазва в сместа чрез добавяне на суспензия от еритроцити. Аглутинацията на еритроцитите показва наличието, а липсата на хемаглутинация показва липсата на вирус в сместа. Изчезването на вируса от сместа вирус + серум се разглежда като знак за взаимодействието на серумните антитела и вируса.

Но антителата взаимодействат с антигените в строго определени количествени съотношения. Следователно, за да може определено количество от вируса да бъде лишено от способността за хемаглутиниране, е необходим определен минимум антитела и тъй като един от компонентите на RTGA винаги е неизвестен, е необходимо реакцията да се постави в ред епруветки с различни дози антитела и същите дози на вируса, или обратно. Това се постига, като се вземат или различни серумни разреждания и едно и също разреждане на вируса, или различни разреждания на вируси и едно и също серумно разреждане.

RTGA позволява решаване на следните задачи: да се определи титърът на антителата към хемаглутиниращ вирус в серума; идентифициране на неизвестен хемаглутиниращ вирус чрез известни серуми; за установяване на степента на антигенна връзка на два вируса.

Предимства на RTGA:простота на технологията, бързина, стерилна работа не се изисква, специфичност, ниска цена. Недостатък: RTGA е възможен само с хемаглутиниращи вируси.

Принцип на титруване на антитела в RTGAе както следва:

- пригответе серия от последователни (обикновено 2-кратни) разреждания на тествания серум в равни обеми (обикновено 0,25 или 0,2 ml);

- към всяко разреждане добавете същите обеми хомоложен вирус в титър от 4 HAU;

- смесите се държат за определено време при определена температура (за вируса на Нюкасълска болест 40-60 минути при стайна температура);

- към всички смеси се добавят равни обеми от 1% суспензия от промити еритроцити;

- след експозиция, оценете хемаглутинацията във всяка смес при кръстоски.

Реакцията включва контроли за серум, вирус и еритроцити.

Най -високото разреждане на серума, което все още напълно инхибира хемаглутинацията, се приема като индикатор за титъра на антителата в този серум.

Използване на реакции на хемадсорбция във вирусологията.

RGAD.Хемадсорбцията - връзката на еритроцитите с повърхността на клетките, засегнати от вируса - е открита за първи път от Vogel и Shchelokov (1957) върху тъканна култура, заразена с грипния вирус. Това явление се основава на връзката на рецепторите на вируса, разположени на повърхността на засегнатата клетка, с рецепторите на еритроцитите, което води до тяхната взаимна адхезия, подобна на реакцията на хемаглутинация. Предимството на тази реакция е, че тя става положителна още преди появата на различни цитопатични промени в заразените клетки.

RGAD методологияе както следва. На 3-4-ия ден след заразяването на клетките вземете две епруветки със същата култура от клетки, едната от които е заразена с ваксиниран материал, а втората е контролна. Културната течност се източва от двете епруветки и към двете се добавят 2-3 капки 0,5% суспензия от промити еритроцити. И двете епруветки се оставят за 5-10 минути, така че еритроцитите да са на повърхността на клетките (поставени хоризонтално върху масата), след което леко се изплакват с физиологичен разтвор и се изследват под микроскоп (ниско увеличение). В контролната тръба червените кръвни клетки се отстраняват напълно с физиологичен разтвор, а някои от останалите плуват с течността. Ако в заразена епруветка еритроцитите не се отстраняват с физиологичен разтвор и не плават, а са прикрепени към повърхността на клетките, RHAD трябва да се счита за положителен.

В зависимост от вируса и вида на клетките, местоположението на червените кръвни клетки може да бъде тройно:

- еритроцитите се адсорбират само по периферията на клетъчния слой под формата на „огърлица“ (вирус на африканската чума по свинете);

- еритроцитите са разположени върху клетъчния слой в огнища или клъстери (грипен вирус);

- еритроцитите са дифузно разположени върху клетъчния слой (парагрипен вирус).

Всеки вирус е способен да адсорбира червените кръвни клетки на определени видове животни.

Серологична диагностика на вирусни заболявания въз основа на увеличаване на титъра на антителата в сдвоени кръвни серуми.

Реакция на хемаглутинация (RHA) и реакция на инхибиране на хемаглутинация (RTGA), механизъм, компоненти и приложение на реакциите.

Реакцията на хемаглутинация се основава на явлението адхезия на еритроцитите, което възниква под въздействието на различни фактори. Разграничаване на директна и индиректна хемаглутинация.

Първо, еритроцитите се промиват с изотоничен разтвор на натриев хлорид, след това, ако е необходимо (когато се използват антигени с протеинова природа), те се третират с разтвор на танин 1: 20 000 и се сенсибилизират с разтворими антигени. След промиване с буфериран изотоничен разтвор на натриев хлорид, еритроцитният антиген е готов за употреба.

Изследваните серуми се разреждат с изотоничен разтвор на натриев хлорид в епруветки или специални пластмасови плаки с ямки, след което към всяко разреждане на серума се добавя диагностичен еритроцит. Резултатите от реакцията на непряка хемаглутинация се вземат предвид от естеството на утайката от еритроцити, образувана на дъното на епруветката. Резултатът от реакцията се счита за положителен, при който червените кръвни клетки равномерно покриват цялото дъно на епруветката. В случай на отрицателна реакция, еритроцитите под формата на малък диск или "бутон" са разположени в центъра на дъното на епруветката

Основните компоненти на RP:

А) разтворим антиген,

Б) Специфични антитела (серум)

(RTGA) е метод за идентифициране на вирус или откриване на антивирусни антитела в кръвния серум на пациента, базиран на явлението отсъствие на аглутинация на еритроцитите от лекарство, съдържащо вирус в присъствието на имунен към него серум.
въз основа на блокада, потискане на антигени на вируси от антитела на имунния серум, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират еритроцитите.

RTGA се използва за диагностициране на много вирусни заболявания, чиито причинители (грип, морбили, рубеола, вируси на енцефалит, пренасян от кърлежи и др.) Могат да аглутинират еритроцитите на различни животни.
Механизъм.Типизирането на вируса се извършва в реакцията на инхибиране на хемаглутинацията (RTGA) с набор от специфични за типа серуми. Резултатите от реакцията се вземат предвид при липса на хемаглутинация. Вирус А подтипове с антигени H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и др.

могат да бъдат диференцирани в RTGA с набор от хомоложни специфични за типа серуми.

В основата на реакции на хемаглутинация се крие явлението адхезия на еритроцитите, което възниква под въздействието на различни фактори.

Разграничаване на директна и индиректна хемаглутинация.
В реакцията на директна хемаглутинация, еритроцитите се слепват, когато върху тях се адсорбират определени антигени, например вируси.
При серологични проучвания се използва директна реакция на инхибиране на хемаглутинацията, когато вирус, изолиран от пациент, се неутрализира със специфичен имунен серум и след това се комбинира с еритроцити.

Липсата на хемаглутинация показва съответствието на вируса и използвания имунен серум.

Реакцията на непряка хемаглутинация (пасивна хемаглутинация) се наблюдава в случаите, когато имунният серум или серумът на пациента със съответните антитела се добавя към еритроцитите, предварително третирани (сенсибилизирани) с различни антигени.

Има специфично залепване на еритроцитите, тяхната пасивна хемаглутинация.

Реакцията на индиректна или пасивна хемаглутинация по чувствителност и специфичност превъзхожда другите серологични методи и се използва за диагностика на инфекции, причинени от бактерии, рикетсии, протозои.

Техниката на поставяне на реакцията на индиректна хемаглутинация се състои от няколко етапа.

Първо, еритроцитите се промиват с изотоничен разтвор на натриев хлорид, след това, ако е необходимо (когато се използват антигени с протеинова природа), те се третират с разтвор на танин 1: 20 000 и се сенсибилизират с разтворими антигени.

След промиване с буфериран изотоничен разтвор на натриев хлорид, еритроцитният антиген е готов за употреба. Изследваните серуми се разреждат с изотоничен разтвор на натриев хлорид в епруветки или специални пластмасови плаки с ямки, след което към всяко разреждане на серума се добавя диагностичен еритроцит.

Резултатите от реакцията на непряка хемаглутинация се вземат предвид от естеството на утайката от еритроцити, образувана на дъното на епруветката. Резултатът от реакцията се счита за положителен, при който червените кръвни клетки равномерно покриват цялото дъно на епруветката. Ако реакцията е отрицателна, червените кръвни клетки под формата на малък диск или "бутон" са разположени в центъра на дъното на епруветката.

Реакция на инхибиране на хемаглутинация- серологична реакция, основана на способността на антителата да предотвратят аглутинацията на еритроцитите от хемаглутиниращи вируси (аденовируси, арбовируси, някои ентеровируси, грипни и парагрипни вируси, морбили, реовируси).

Специфични антивирусни антитела взаимодействат с повърхностните хемаглутининови молекули на вирионите на тези вируси и блокират тяхното свързване с комплементарни мембранни молекули на еритроцитите.

Напоследък реакцията е широко използвана в лаборатории по клинична вирусология за определяне на титрите на специфични антитела към определени вируси, както и за серологична идентификация и типизиране на вирусни изолати от клиничен материал от пациенти.

Използват се донякъде ограничено поради наличието в кръвния серум на хора на неспецифични инхибитори на вируси, както и естествени антитела - аглутинини.

Реакцията на неутрализация е реакция на инхибиране на хемаглутинация (RTGA).

Прилага се RTGA:
-за серотипиране на вируси;
- за серодиагностика на инфекции.
Има два начина за поставяне:
- капещ метод върху стъкло (приблизителна реакция), използван за сиво копиране на вируси;
- разгънати в епруветки.

Механизъм.

Някои вируси (например грип) имат хемаглутинин, който причинява аглутинация на червените кръвни клетки при различни животни, в зависимост от вида на вируса.

При наличие на антитела в серума - антихемаглутинини, се наблюдава инхибиране на активността на вирусите.
RTGA.
Цел: Серотипиращ вирус на грип А

Компоненти:
1. Изпитващ материал - алантоична течност на пилешки ембрион,
2. Диагностичен тип-специфичен антигрипен серум,
3,5% суспензия от пилешки еритроцити.
4.

Физиологичен разтвор.

Реакцията се поставя върху стъклото по капещ метод. Нанесете 1 капка диагностични серуми и тестов материал върху стъклото, разбъркайте, след това добавете 1 капка суспензия от еритроцити. При положителна реакция се наблюдава хомогенно зачервяване, а при отрицателна реакция изпадат червени люспи (хемаглутинация).

Предишна31323334353637383940414243444546Следваща

Характеристика на грипните вируси. Епидемиология и диагностика на грип. Използване на RTGA за серотипиране на грипни вируси. Препарати за специфична профилактика и лечение.

Грип или грип - остър инфекцияхарактеризира се с увреждане на лигавиците на горната част респираторен тракт, треска, обща интоксикация, нарушена дейност на сърдечно -съдовата и нервната система.

Грипът се характеризира с тенденция към епидемично и пандемично разпространение поради високата заразност и променливостта на патогена.

Характеристики на патогените. Към това принадлежат патогени - грипни вируси. Orthomyxoviridae, родовете Influenzavirus A, B и Influenzavirus C. Грипните вируси са РНК вируси. Вирусът на грип тип А е изолиран през 1933 г. от W. Smith, K. Andrews, P. Laidlaw. През 1940 г. Т.

Приложение на метода на хемаглутинация във вирусологията.

Франсис и Р. Медгил изолират грипни вируси от тип В, ​​през 1949 г. Р. Тейлър - тип С. В Русия първите грипни вируси са изолирани през 1936 г. от А. А. Смородинцев и класифицирани като тип А. Морфология. Грипните вируси имат сферична форма (форма на топка) - 80 - 120 nm, по -рядко имат нишковидна форма. Те се състоят от: 1) ядро ​​-нуклеокапсид със спирален тип симетрия (едноверижна линейна " -" -струна от РНК + протеинов капсид); 2) базална мембрана - външна липопротеинова мембрана - суперкапсид.

На повърхността на мембраната има 2 вида гликопротеини (под формата на тръни и ворсинки): 1) хемаглутинин - насърчава прикрепването към клетъчните рецептори; 2) невраминидаза - насърчава освобождаването на вируса от клетката. Култивиране. За отглеждане се използват пилешки ембриони, първични трипсинизирани клетъчни култури, а понякога и лабораторни животни.

Най-удобният модел са пилешки ембриони на възраст 10-12 дни. Тя ви позволява да получите големи количества от вируса, който е необходим при производството на ваксини и бактериални препарати.

Инфекцията се извършва в алонтоичната кухина, в хорион-алонтоичната мембрана, в околоплодната кухина, в амниона. Наличието на вируса в пилешкия ембрион се открива в реакцията на хемаглутинация. Антигенна структура. Вирусите имат вътрешен антиген-S и повърхностни антигени: НА-хемаглутинин и NA-невраминидаза. S-антигенът е специфичен за групата, общ за целия тип, за този антиген грипните вируси са разделени на типове А, В и С. Това е комплементно-свързващ, стабилен (непроменен) антиген.

HA и NA антигените са специфични антигени. HA антигенът предизвиква образуването на неутрализиращи вируса антитела и адхезията на еритроцитите.

NA антигенът предизвиква образуването на антитела, които частично неутрализират вирусите.

Вирусът тип В е по -малко променлив, а тип С е много стабилен.

Токсични свойства. Токсичният ефект на вируса върху тялото ( главоболие, мускулна болка, температура, катарални явления) се причинява от протеините на вируса (най -вирусната частица). Това действие е строго специфично и се неутрализира само от имунен серум от съответния тип или подтип или от серума на тези, които са били болни. Съпротивление. Грипните вируси са чувствителни към UV лъчи, дезинфектанти (формалин, алкохол, фенол, хлорамини) и мастни разтворители.

В течна среда те умират при температура 50 - 60 ° C в рамките на няколко минути. При стайна температура във въздуха вирусите остават заразни за няколко часа. Те се съхраняват дълго време в изсушена форма, а в замразено състояние (-70 ° C) те не само продължават дълго време, но и не губят вирулентност.

Възприемчивостта на животните. При естествени условия вирусите от тип А заразяват хора и животни (коне, свине се разболяват), а вируси от типове В и С - само хора. Сред лабораторните животни бели мишки, африкански порове, сирийски хамстери и маймуни са податливи на вируси.

Заболяването при животните се характеризира с белодробно увреждане, фебрилно състояние и може да доведе до смърт на животните. Епидемиология на заболяването. Източникът на инфекция е болен човек с клинично изразена или безсимптомна форма. Болен човек освобождава вируса в околната среда при кашляне, говорене, кихане с капки слюнка, слуз, храчки още през инкубационния период.

Пациентът става заразен 24 часа преди появата на основните симптоми и представлява епидемична опасност в рамките на 48 часа след изчезването им.

Механизмът на предаване е аерогенен. Маршрутът на предаване е по въздух. Хората са много податливи на грип. Всички възрастови групи са болни, главно през зимата. Най -податливи са децата и възрастните хора. Името на болестта отразява особеностите на епидемиологията: грип от френски. грайфер - за хващане, грип - от италиански. Influenza di freddo - влиянието на студа.

От всички остри респираторни заболяваниягрипът е най -разпространеното и сериозно заболяване. Грипните пандемии и епидемии обхващат до 30-50% или повече от световното население, причинявайки огромни щети на здравето и икономиката на страните. Първите описания на грипните епидемии датират от 12-14 век. Появата на пандемии и големи епидемии се причинява от вируса на грип тип А, който се дължи на голямата вариабилност на вируса и се свързва с появата на нов подтип в резултат на изместването на антигена.

Между пандемиите епидемичните огнища се появяват на всеки 1,5-2 години, което е свързано с антигенно разнасяне на вируси. През 1918 г. пандемията от испански грип (1,5 милиарда души се разболяха, 20 милиона умряха) е причинена от грипния вирус А1. Първоначално регистрирана в Испания, тази пандемия обхваща почти цялото население на Земята; заболяването се характеризира с развитието на изключително тежка хеморагична пневмония с рекордна смъртност (до 1% от всички случаи).

През 1957 г. "азиатската" пандемия (2 милиарда души се разболяха) е причинена от нов подтип - подтип А2. През 1968 г. пандемията „Хонконг“ (1 милиард души се разболяха) е причинена от новопоявил се подтип - подтип А3. По правило нов вариант на вируса измества по -ранен циркулиращ сорт от човешката популация.

Но през 1977 г., след 20-годишна пауза, тип А1 внезапно „се завръща“, което води до голяма епидемия. Следователно изместените варианти на грипния вирус продължават и на определени интервали от време могат отново да предизвикат епидемия. Вирус тип В причинява локални епидемии, а тип С не причинява епидемии. Патогенеза и клинична картина на заболяването. Входната врата е горният дихателен път. Вирусът нахлува в епителните клетки на лигавицата и се размножава в тях.

Ефектът на вируса върху епителните клетки причинява тяхната некроза и десквамация (отхвърляне) на епитела, в резултат на което лигавицата става пропусклива за вируси и бактерии. Те навлизат в кръвния поток и се разпространяват по цялото тяло. ”Виремията е придружена от множество лезии на капилярния ендотел с увеличаване на тяхната пропускливост.

В тежки случаи има обширни кръвоизливи в белите дробове, миокарда, паренхимните органи. Продуктите на разпадане на увредени клетки и вирусни протеини имат токсичен ефект върху различни органи и органи. Токсините на вируса силно инхибират централната нервна система и въпреки че процесът не продължава дълго (3 - 5 дни), болният остава отслабен за дълго време и някаква вторична инфекция се присъединява към отслабеното тяло и възникват усложнения: грип пневмония, остър белодробен оток, бъбречно увреждане, сърце, бронхи.

Често усложнение на грипа е бактериалната пневмония (стрептококи от група В). По време на пандемията от испански грип хората умират главно от вторична бактериална пневмония.

В патогенезата на грипа е важна не само интоксикацията, но и алергизацията, както и нарушаването на функционалните свойства на имунокомпетентните клетки с развитието на имунодефицит. Инкубационен период- няколко часа - 1-3 дни. Характеризира се с остро начало, повишаване на температурата до 37,5 - 38 ° C, обща интоксикация, изразена в неразположение, главоболие, болка в очни ябълки, възпалителни процеси на дихателните пътища с различна тежест (ринит, ларингит, трахеит, фарингит).

Треска с грип без усложнения продължава 5-6 дни. Имунитет. След пренесеното заболяване се формира типоспецифичен и щамоспецифичен имунитет, който се осигурява от специфични и неспецифични клетъчни и хуморални фактори. Антителата на Ig А са от голямо значение. Кръстосаният имунитет не се развива, след прехвърляне на грип тип А1 можете да се разболеете от грип тип А2 и т.н. След вируса тип, имунитетът е 1-2 години, след вируса тип В - 3 - 5 години.

Пасивен естествен имунитет - при деца под 8 - 11 месеца. Поради високата антигенна вариабилност на вируса, възстановяването не води до развитие на устойчива резистентност към повтарящи се инфекции.

Лабораторна диагностика. Тестов материал: размазки-отпечатъци от лигавицата на носната кухина, отделяне на назофаринкса, парчета от белите дробове, мозък в случай на смърт.

Диагностични методи: 1) метод на циториноскопия - откриване на вътреклетъчни включвания, специфични за вируса - при оцветяване с пиоктанин под микроскоп се виждат яркочервени включвания на грипния вирус в клетките на цилиарния епител; 2) вирусологичен метод - изолирането на грипния вирус от човешкото тяло чрез заразяване на пилешки ембриони чрез измиване от носоглътката на пациента; индикацията (присъствието) на вируса се извършва с помощта на RHA (грипни вируси аглутинират еритроцитите на хора и различни животни), идентифицирането на вируса се извършва на етапи: видът се определя в RSC, подтип хемаглутинин - в RTGA, и подтипа невраминидаза - в реакцията на инхибиране на ензимната активност; 3) серологичен метод - откриване на увеличаване на титъра (4 пъти) на специфични антитела в кръвния серум на пациента с помощта на RSK, RTGA, RN в клетъчна култура, реакция на утаяване в гел, ELISA; 4) биологичен метод - интраназална инфекция на мишки - въвеждане на материал в белите дробове под етерна анестезия; мишките умират след 2 до 3 дни в резултат на пневмония; 5) експресна диагностика - откриване на вирусен антиген с помощта на RIF.

Лечение и профилактика.

За профилактика и лечение в първите дни на заболяването се използва човешки левкоцитен интерферон (интраназално). V лечебни целиизползвайте антивирусни лекарства- ремантадин (грипен тип А), адапромин, виразол и имуномодулиращи лекарства - дибазол, продигиозан, левомизол.

При тежък грип, особено при деца, се използва донорски противогрипен имуноглобулин, както и лекарства - инхибитори на клетъчните протеази (гордокс, контрикал, аминокапронова киселина).

Специална профилактика. Използват се следните антивирусни лекарства и имуномодулатори, както и ваксини - живи и инактивирани: 1) живи моноваксини за перорално приложение - атенюирани щамове вируси, циркулиращи в момента (А1, А3 и В); проявяват най -голяма имуногенност; 2) ваксини от цял ​​вирион от вирулентни щамове, инактивирани от формалдехид или UV лъчи; 3) субединични грипни ваксини само от повърхностни антигени - HA и NA -антигени (имат минимална реактогенност).

За да се получат ваксини, вирусите се култивират в ембриони на пилета и в клетъчна култура на пилешки ембриони.

С въвеждането на ваксини се формира местен и хуморален имунитет. Ваксинацията се извършва в периоди на най -голям риск от епидемии. Показан е предимно за млади и възрастни хора. Използването на убити ваксини изисква годишна реваксинация; ефективността им не надвишава 60 - 70%.

Защото Тъй като често се наблюдават антигенни вариации на патогена, наборът от антигени на съответния вирус за имунизация може да бъде определен само след началото на огнището.

Билет 15.

Реакция на хемаглутинация (RHA).

В лабораторията те използват две реакции на хемаглутинация, които се различават по механизма на действие.

Първият RHA е серологичен. При тази реакция червените кръвни клетки аглутинират при взаимодействие със съответните антитела (хемаглутинини).

Реакцията се използва широко за определяне на кръвни групи.

Вторият RHA не е серологичен. При него адхезията на еритроцитите не се причинява

антитела и специални вещества, образувани от вируси. Например грипният вирус аглутинира еритроцитите на пилета и морски свинчета, вирусът на полиомиелит - еритроцитите на овцете. Тази реакция дава възможност да се прецени наличието на определен вирус в тестовия материал.

Реакцията се провежда в епруветки или на специални плочи с отвори.

Материалът, който ще се тества за наличие на вируса, се разрежда с изотоничен разтвор от 1:10 до 1: 1280; 0,5 ml от всяко разреждане се смесва с равен обем от 1-2% суспензия от еритроцити. В контролата 0,5 ml еритроцити се смесват с 0,5 ml изотоничен разтвор. Епруветките се поставят в термостат за 30 минути, а плочите се оставят при стайна температура за 45 минути.

Отчитане на резултатите.При положителен резултатреакция на дъното на епруветката или кладенчето, изпада утайка от еритроцити с оформени ръбове („чадър“), покриваща цялото дъно на кладенчето.

Реакция на инхибиране на хемаглутинация

Ако резултатът е отрицателен, еритроцитите образуват плътна утайка с гладки ръбове ("бутон"). Същата утайка трябва да се контролира.

Интензивността на реакцията се изразява със знаци "+". Титърът на вируса е максималното разреждане на материала, в който настъпва аглутинация.

Реакция на инхибиране на хемаглутинация

Това е серологична реакция, при която специфични антивирусни антитела, взаимодействащи с вирус (антиген), го неутрализират и го лишават от способността да аглутинира еритроцитите, т.е.

Тоест, те инхибират реакцията на хемаглутинация. Тази реакция ви позволява да определите вида и вида на вирусите.

Изложение на реакцията. 0,25 ml антивирусен серум се смесва с равен обем материал, съдържащ вируса. Сместа се разклаща и се поставя в термостат за 30 минути, след което се добавят 0,5 ml'1-2% суспензия от еритроцити.

Отчитане на резултатите.При правилната настройка на експеримента при контрола на серума и еритроцитите, трябва да се образува "бутон" - няма фактор, аглутиниращ еритроцитите; при контрола на антигена се образува „чадър“ - вирусът предизвиква аглутинация на еритроцитите.

Ако серумът е хомологичен на изследвания вирус, се образува "бутон" - серумът е неутрализирал вируса.

Непряка реакция на хемаглутинация

Индиректната (пасивна) реакция на хемаглутинация (RIGA) се основава на факта, че еритроцитите, ако разтворим антиген се адсорбира на повърхността им, придобиват способността да аглутинират при взаимодействие с антитела към адсорбирания антиген.

Изложение на реакцията.

Серумът се загрява в продължение на 30 минути при 56 ° С, разрежда се последователно в съотношение 1:10 - 1: 1280 и се излива в епруветки или ямки от 0,25 ml, където след това се добавят 2 капки еритроцити с адсорбирани върху тях антигени.

Контроли:суспензия от еритроцити с антигени, адсорбирани върху тях с очевидно имунен серум, суспензия от еритроцити с антигени, адсорбирани върху тях с нормален серум; суспензия на нормални еритроцити с тествания серум.

При първата контрола трябва да настъпи аглутинация, при втората и третата не трябва да има.

Контролни въпроси.

1. Какво показва положителен резултат от RHA между еритроцитите и материала, тестван за наличие на вируса?

2. Ще възникне ли реакцията на аглутинация на еритроцитите, ако към тях се добави вирусът и съответният серум?

Как се казва реакцията, която разкрива това явление?

ПРАКТИЧЕСКА РАБОТА No 12.

Реакция на свързване на комплемента.

Реакцията за свързване на комплимента (CSC) се основава на факта, че специфичен комплекс антиген-антитяло винаги адсорбира (свързва) комплемента върху себе си.

Тази реакция се използва широко при идентифицирането на антигени и при серодиагностиката на инфекции, особено заболявания, причинени от спирохети (реакция на Васерман), рикетсии и вируси.

RCC-сложна серологична реакция.

Той включва комплемент и две системи антиген-антитяло. По същество това са две серологични реакции.

Дясната система - основната - се състои от антиген и антитяло (едното е известно, другото не е). Към него се добавя определено количество комплемент. Когато антигенът и антителата на тази система съвпадат, те ще комбинират и свързват комплимента. Полученият комплекс е фино диспергиран и не се вижда.

Образуването на този комплекс се разпознава с помощта на втора хемолитична или индикаторна система.

Той включва овчи еритроцити (антиген) и съответния хемолитичен серум (антитяло), т.е. готов имунен комплекс. В тази система лизис на червените кръвни клетки може да възникне само в присъствието на комплемент. Ако комплементът е свързан с първата система, тогава няма да има хемолиза във втората система;

без безплатно допълнение. Отсъствието на хемолиза (съдържанието на епруветката е мътно или на дъното на утайката от еритроцити) се записва като положителен CSC резултат.

Ако в първата система антигенът не съответства на антитялото, тогава имунният комплекс не се образува и комплиментът ще остане свободен. Оставайки свободен, комплиментът участва във втората система, причинявайки хемолиза, резултатът от CSC е отрицателен (съдържанието на епруветките е прозрачна "лакова кръв").

Компоненти, реакции на свързване на комплемента:

Антиген - обикновено лизат, екстракт, хаптен,

по -рядко суспензия на микроорганизми.

2. Антитяло - серум на пациента.

3. Допълнение - серум от морско свинче.

Антиген - овчи еритроцити.

5. Антитяло - хемолизин към овчи еритроцити.

6. Изотоничен разтвор.

Поради факта, че в DGC участват голям брой сложни компоненти,

те трябва да бъдат предварително титрувани и въведени в реакцията в точни количества и в равни обеми: по 0,5 или 0,25 всеки, по-рядко 0,2,1,25 или 1,0 ml (големи обеми дават по-точен резултат). Титруването на реакционните компоненти се извършва в същия обем като експеримента, като се заменят липсващите съставки с изотоничен разтвор.

Подобна информация:

Търсете в сайта:

Тя се основава на факта, че еритроцитите, върху които антигените са предварително адсорбирани, придобиват способността да аглутинират в присъствието на хомоложни серуми (антитела).

В този случай еритроцитите действат като носители със специфични детерминанти, чиято аглутинация настъпва в резултат на реакцията антиген + антитяло.

Еритроцитите, към повърхността на които антигените са здраво прикрепени, се наричат ​​еритроцитен антигенен диагностикум или еритроцити, сенсибилизирани с антиген.

Друг вид RNGA - антитела се адсорбират върху повърхността на еритроцитите и последващата им аглутинация настъпва в присъствието на хомоложен антиген.

В този случай такива еритроцити се наричат ​​диагностично средство за еритроцитни антитела или еритроцити, сенсибилизирани с антитела.

Въз основа на тези два основни методологични подхода са разработени и се използват много модификации на RNGA. По този начин малки стандартни частици от латекс се използват като носители.

Реакция на инхибиране на хемаглутинация (RTGA)

В този случай реакцията се нарича реакция на латексна аглутинация (RLA) или се използва Staphylococcus aureus - реакцията на коаглутинация и др. Обикновено диагностиката на еритроцитите се изготвя в предприятията на биологичната промишленост, а в диагностичните лаборатории те вече поставят основните опит от RNGA.

Подготовката за диагностика на еритроцити включва следните стъпки:

• фиксиране на еритроцити с формалдехид или глутарал, или акрилни алдехиди.

  Такива преработени еритроцити се задържат дълго време. Най -често за тази цел се използват еритроцити на овен, хора, пилета и т.н.

• лечение на фиксирани еритроцити с разтвор на танин. В резултат на това еритроцитите придобиват свойството да необратимо адсорбират протеини (вируси и антитела) на повърхността си;
• сенсибилизация на дъбени еритроцити с вируси или антитела.

Трябва да се отбележи, че методите за изготвяне на еритроцитна диагностика за вирусни инфекции са различни.

Техниката за определяне на RNGA за откриване и определяне на титъра на антителата е, както следва:

• равни дози от антиген-сенсибилизирани еритроцити се добавят към серийни двукратни разреждания на серум;
• сместа се оставя за 2-3 часа при стайна температура или за 16-18 часа при 4 ° С;
• вземете предвид резултатите.

  Ако серумът съдържа антитела към вируса, който е сенсибилизирал еритроцитите, се наблюдава хемаглутинация, която се оценява в кръстоски.

За титъра на антителата в серума се взема най -голямото разреждане на серума, което все още осигурява хемаглутинация с поне два кръста.

RNGA е придружен от всички съответни контроли. Обикновено реакцията се извършва по микрометод.

RNGA ви позволява да решавате следните диагностични задачи:

• откриване на антитела и определяне на техния титър в кръвния серум, като се използва известен еритроцитен антигенен диагностикум;
• откриване и идентифициране на неизвестен вирус с помощта на известен диагностичен тест за еритроцитни антитела.

Предимства на RNGA: висока чувствителност, простота на настройка и бърза реакция.

Важно е обаче да се отбележи, че има големи трудности при изготвянето на стабилна диагностика на еритроцитите (голяма зависимост от чистотата на използваните компоненти, необходимостта от избор на режим на фиксиране, танизация и сенсибилизация на еритроцитите за всеки тип вирус).

Ако откриете грешка, моля, изберете част от текста и натиснете Ctrl + Enter.

Във връзка с

съученици

Той използва еритроцити или неутрални синтетични материали (например частици от латекс), на повърхността на които се сортират антигени (бактериални, вирусни, тъканни) или антитела.

Тяхната аглутинация възниква, когато се добавят подходящи серуми или антигени. Еритроцитите, сенсибилизирани с антигени, се наричат ​​антигенни еритроцитни диагностици и се използват за откриване и титруване на антитела. Еритроцити, чувствителни към антитела. се наричат ​​имуноглобулинови еритроцитни диагностикуми и се използват за откриване на антигени.

Пасивната реакция на хемаглутинация се използва за диагностициране на заболявания, причинени от бактерии (коремен тиф и паратиф, дизентерия, бруцелоза, чума, холера и др.), Протозои (малария) и вируси (грип, аденовирусни инфекции, вирусен хепатитВ, морбили, кърлежов енцефалит, Кримска хеморагична треска и др.), Както и за определяне на някои хормони, за идентифициране на свръхчувствителността на пациента към лекарства и хормони, като пеницилин и инсулин.

Реакция на пасивна хемаглутинация (RPHA).

Пасивната реакция на хемаглутинация е чувствителен метод за серологична диагностика и се използва както за ранна, така и за ретроспективна диагностика, както и за определяне на имунопогичното състояние на ваксинираните. При пациенти с туларемия обикновено се откриват антитела в края на 1-ва или 2-ра седмица на заболяването, след 1-1,5 месеца титрите на RPHA достигат максимални стойности (1: 100000-1: 20 000, по-рядко по-високи), след които те намаляват на ниво 1: 100-1: 200 се съхраняват за дълго време.

При ваксинирани антитела също се откриват постоянно, но при по-ниски титри, които не надвишават 1: 2000-1: 5000 1-1,5 месеца след ваксинацията, те остават няколко години на ниско ниво 1: 20-1: 80.

Туларемия еритроцитен диагностик (антигенен) служи като антиген за RPHA.

Лекарството представлява формализирани овчи еритроцити, сенсибилизирани с антиген на туларемия, произведен в течна и суха форма. Течен препарат - 10% суспензия на еритроцити в 10% разтвор на формалин. Сух лиофилизиран препарат - сушена под вакуум 10% суспензия на еритроцити без консервант. Преди употреба се разрежда според указанията на етикета. За определяне на реакцията в полистиролни плаки и двете лекарства се използват в концентрация 2,5%, а при настройка на реакцията в микрообем - в концентрация 0,5%.

Техника за поставяне на RPGA.

Тестваните серуми се разреждат с физиологичен разтвор 1: 5 (1:10) и се нагряват при 56 ° С за 30 минути.

Реакция на хемаглутинация (RHA) и

След това, за да се отстранят хетерогенни антитела към агнешки еритроцити, серумите се третират с 50% суспензия от формализирани агнешки еритроцити. За това се добавят еритроцити в размер на 2 капки (по 0,05 ml всяка) на 1 ml серум и се разбъркват старателно чрез разклащане.

Серумът се оставя до пълното утаяване на еритроцитите или се центрофугира след един час при стайна температура, след което е готов за изследване.

Разреждащата течност се излива в обем от 0,5 ml в редица отвори на полистиролова плоча.

При предварително проучване на серуми е препоръчително да се тестват чрез поставяне на реакцията в кратък ред на плаката (6 гнезда). Ако се открият антитела в къс ред, серумите се тестват отново в дълъг ред за разреждане (12 ямки).

След като разлеете разреждащата течност, добавете 0,5 ml от тестваните серуми в разреждане 1: 5 към първата ямка от всеки ред (къса или дълга). След това в същите обеми серум се титрува с двукратни разреждания. По този начин се получават серумни разреждания в късите серии от 1:10 до 1: 320 и в дългите серии от 1:10 до 1: 20480. След титруване на серуми, една капка (0,05 ml) от работеща 2,5% суспензия от сенсибилизирани еритроцити се добавя към всяка ямка.

Съдържанието на плочите се разклаща старателно, докато се получи хомогенна суспензия. Плочите се оставят при стайна температура върху неподвижна повърхност на масата. Предварително регистриране на реакцията се извършва след 2-3 часа, окончателното определяне на титъра се извършва след пълно утаяване на еритроцитите в ямките. За реакцията са предвидени следните контроли: 1) изпитваният серум в разреждане 1:10 в обем от 0,5 ml + 1 капка от 2,5% суспензия от нечувствителни еритроцити; 2) разреждаща течност в обем 0,5 ml + 1 капка 2,5% суспензия от нечувствителни еритроцити; 3) разреждаща течност в обем 0,5 ml + 1 капка 2,5% суспензия от сенсибилизирани еритроцити.

Всички контроли трябва да са явно отрицателни.

Счетоводство и оценка на RPGA. Реакцията се оценява по следната схема:

1) рязко положителна реакция (++++) - еритроцитите падат на дъното на дупката в равномерен слой под формата на „чадър“, който често има остриета с ръбове;

2) положителна реакция (+++) - еритроцитите покриват поне 2/3 от дъното на кладенчето;

3) слабо положителна реакция (++) - аглутинатът е малък и се намира в самия център на дупката;

4) съмнителна реакция (+) - има отделни зрънца аглутинат около утайката на еритроцитите в самия център на дупката;

5) отрицателен ( -) - в дъното на дупката еритроцитите се утаяват под формата на „копче“ или малък пръстен с гладки, остро очертани ръбове.

Серумният титър се взема предвид според последното разреждане на серума, което дава доста ясна реакция (поне три плюса).

Разреждането от 1: 100 и по -високо се счита за диагностичен титър, но, както в случая на RA, е необходимо да се следи неговото увеличение.

RPHA при туларемия е доста специфичен и показва някои кръстосани реакции само със серуми на бруцелоза. Диференциална диагнозавъзможно с височината на титрите в RPHA, които са значително по -високи с хомоложен антиген.

Техника за настройка на RPGA в микрообем.

RPGA може да се извърши в микрообем с помощта на микротитър от тип Takachi (или микротитърни плочи с кръгло дъно с микропипети), което позволява титруване на материала в обеми от 25 μl и 50 μl. Техниката на настройване на реакциите, последователността на всички операции е същата като при изследването в полистиролни плочи. Трябва обаче да се има предвид, че чувствителността на микрометода обикновено е едно разреждане (т.е.

2 пъти) по -ниска от макро метода.

За да се настрои реакцията в микротитър, към всяка ямка се добавя разреждаща течност в обем от 50 μl с помощта на пипета с капкомер. След това, с помощта на титратори с 50 μl глава, серумът за изпитване се взема чрез потапяне на главата в него.

Уверете се, че течността е напълнила главата на титратора. Прехвърлете титратора със серум в първата ямка и, като го държите в изправено положение, направете няколко въртеливи движения в двете посоки. След това титраторът се прехвърля в следващата ямка и манипулацията се повтаря. Титруването може да се извърши едновременно в няколко реда. След титруване на целия ред титраторът се промива с дестилирана вода (с промяна на 2 порции) чрез въртеливи движения, водата се отстранява от главата с помощта на тампон и се изгаря върху пламъка на горелката.

След титруване добавете 25 μl еритроцитен диагностикум към ямките.

Концентрацията на диагностикум за RPHA в микрообем трябва да бъде 0,5% (т.е. 2,5% суспензия от еритроцити се разрежда допълнително 5 пъти). След добавяне на еритроцити, плаките трябва да се разклащат леко, докато се получи хомогенна суспензия. Резултатите могат да бъдат записани в рамките на 1-1,5 часа, което е значително предимство на RPHA в микротитър.

В допълнение, тази техника изисква малко количество от всички съставки на реакцията и тестваните серуми.

Реакцията се взема предвид по следната схема:

1) "+" - пълноценна хемаглутинация, при която еритроцитите падат на дъното на дупката в равномерен слой под формата на "чадър", заемащ поне 2/3 от дъното;

2) "+ -" - частична хемаглутинация, при която еритроцитите падат на дъното под формата на хлабав пръстен с малък размер;

3) " -" - липса на хемаглутинация, когато еритроцитите падат на дъното под формата на малко копче или пръстен с равен ръб.

Специфичността на положителен резултат, получен при RPHA, може да се провери с помощта на трикомпонентна реакция - реакция на инхибиране на пасивна хемаглутинация (RPHA).

Техника за поставяне на RTPGA.

Тази реакция се използва за потвърждаване на специфичността на положителен резултат от RPHA, когато той е съмнителен или от особен епидемиологичен интерес. Реакционният механизъм се състои в специфично инхибиране на хемаглутинацията, когато към тествания серум се добави суспензия от убити бактерии от туларемия. В реакцията взаимодействат три компонента: тестваният серум, специфичен туларемичен антиген и антигенният еритроцитен диагностикум RTPHA обикновено се поставят в ред от 7-8 ямки.

Препоръчително е да инсталирате втора RPGA паралелно с RTPHA. 0,25 ml от разреждащата течност се изсипва в два реда ямки, след това изпитваният серум в обем 0,25 ml се добавя към първите ямки от двата реда и се титрува. Получават се две идентични серии серумни разреждания. Добавете 0,25 ml разреждаща течност към всички ямки от втория ред и 0,25 ml суспензия от бактерии от туларемия към ямките на първия ред.

Използва се диагностичен туларемия (съдържащ 25 милиарда бактерии туларемия в 1 мл), предварително разреден 50 пъти.

Тази суспензия съдържа 500 милиона бактерии в 1 ml или 125 милиона в обем от 0,25 ml. След добавяне на антигена, плочата се оставя за 1 час при стайна температура, след което една капка (0,05 ml) еритроцитен диагностициум се добавя към всички ямки от двата реда, плочата се разклаща и се оставя върху равна повърхност на масата.

Счетоводството се извършва за 2-3 часа.

Счетоводство и оценка на RTPHA. Ако тестваният серум съдържа специфични антитела срещу туларемия, те се неутрализират от добавения антиген и хемаглутинацията няма да настъпи в първия ред на ямките, или при висок серумен титър хемаглутинацията ще бъде отбелязана в по-малък (с 2-4) брой от кладенци, отколкото в реда с RPHA. В този случай се потвърждава специфичността на резултатите.

Ако в двата реда се отбележи хемаглутинация, т.е. резултатите от RTPHA и RPHA съвпадат, това показва липсата на туларемични антитела в тествания серум. В този случай основният резултат от RPHA се признава за неспецифичен.

Техника за настройка на RTPGA в микрообем. RTPHA, както и RPHA, могат да се извършват в микрообем с помощта на микротитър от тип Такачи.

За да направите това, 0,25 μl разреждаща течност се вкарва в ямките на микроплаките в два реда от 7-8 ямки всяка. След това, с помощта на титратор, се отчита 0,25 μl от тествания серум и се титрува в двата реда. След това към всяка ямка в първия ред се добавят 25 μl антиген на туларемия (чиято концентрация е 500 милиона бактерии от туларемия в 1 ml) и към втория ред се добавят 25 μl разреждаща течност.

Плаките се оставят за 1 час при стайна температура, след което към всички ямки от двата реда се добавят 25 μl антигенен спектроцитен диагностикум (концентрация 0,5%).

Резултатите се вземат предвид и оценяват по подобен начин на реакцията в макрообем.

Дата на публикуване: 2015-02-03; Прочетено: 3176 | Нарушаване на авторски права на страницата

studopedia.org - Studopedia.Org - 2014-2018. (0.003 s) ...

Реакцията на инхибиране на хемаглутинацията (RTGA) е метод за идентифициране на вирус или откриване на антивирусни антитела в кръвния серум на пациента, базиран на явлението отсъствие на аглутинация на еритроцитите от лекарство, съдържащо вирус в присъствието на имунен към него серум.

Реакцията на инхибиране на хемаглутинацията (RTGA) се основава на блокада, потискане на вирусни антигени от антитела на имунния серум, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират еритроцитите.

RTGA се използва за диагностициране на много вирусни заболявания, чиито причинители (грип, морбили, рубеола, вируси на енцефалит, пренасян от кърлежи и др.) Могат да аглутинират еритроцитите на различни животни.

Механизъм. Типизирането на вируса се извършва в реакцията на инхибиране на хемаглутинацията (RTGA) с набор от специфични за типа серуми. Резултатите от реакцията се вземат предвид при липса на хемаглутинация.

Вирус А подтипове с антигени H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и други могат да бъдат диференцирани в RTGA с набор от хомоложни типоспецифични серуми.

Реакция на свързване на комплемента. Механизъм. Компоненти. Приложение

Реакцията на свързване на комплемента (CSC) е, че когато антигените и антителата съответстват един на друг, те образуват имунен комплекс, към който комплементът (С) е свързан чрез Fc-фрагмента на антителата, т.е. комплементът е свързан с антиген-антитяло комплекс. Ако комплексът антиген-антитяло не се образува, тогава комплементът остава свободен.

Специфичното взаимодействие на AG и AT е придружено от адсорбция (свързване) на комплемента. Тъй като процесът на свързване на комплемента не се проявява визуално, J. Bordet и O. Zhangu предлагат използването на хемолитичната система (овчи еритроцити + хемолитичен серум) като индикатор, който показва дали комплементът е фиксиран от комплекса AG-AT. Ако AG и AT съответстват един на друг, тоест се образува имунен комплекс, тогава комплементът е свързан с този комплекс и не настъпва хемолиза. Ако AT не съответства на AH, тогава комплексът не се образува и комплементът, докато остава свободен, се свързва с втората система и причинява хемолиза.

Компоненти. Тестът за фиксиране на комплемента (CBC) е сложна серологична реакция. За неговото изпълнение са необходими 5 съставки, а именно: AG, AT и комплемент (първа система), овчи еритроцити и хемолитичен серум (втора система).

Антигенът за CSC може да бъде култура на различни убити микроорганизми, техните лизати, компоненти на бактерии, патологично променени и нормални органи, тъканни липиди, вируси и вирусосъдържащи материали.

Като допълнение се използва пресен или сух серум от морско свинче.

Механизъм. RSK се провежда на две фази: 1 -ва фаза - инкубиране на смес, съдържаща три компонента антиген + антитяло + комплемент; 2 -ра фаза (индикатор) - откриване на свободен комплемент в сместа чрез добавяне към нея на хемолитична система, състояща се от овчи еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ антитела към тях. В първата фаза на реакцията, когато се образува комплексът антиген-антитяло, комплементът се свързва с него, а след това във втората фаза няма да настъпи хемолиза на еритроцитите, сенсибилизирани от антитела; реакцията е положителна. Ако антигенът и антитялото не отговарят един на друг (няма антиген или антитяло в тестовата проба), комплементът остава свободен и във 2-ра фаза той ще се присъедини към комплекса еритроцит-анти-еритроцитни антитела, причинявайки хемолиза; реакцията е отрицателна.

Приложение. RSK се използва за диагностициране на много инфекциозни заболявания, по -специално сифилис (реакция на Васерман).

Твърдофазен ELISA- вариант на теста, когато един от компонентите на имунния отговор (антиген или антитяло) се сортира върху твърд носител, например в ямките от полистиренови плочи. Компонентите се откриват чрез добавяне на белязани антитела или антигени. Ако резултатът е положителен, цветът на хромогена се променя. Всеки път след добавяне на следващия компонент, несвързаните реактиви се отстраняват от ямките чрез промиване,

I. При определяне на антитела (лява фигура), кръвните серуми на пациента, ензим-белязан антиглобулинов серум и субстрат / хромоген за ензима се добавят последователно към ямките на плаките със сорбирания антиген.

II. При определяне на антигена (дясна фигура), към ямките с адсорбирани антитела се добавя антиген (например кръвен серум с желания антиген), диагностичен серум срещу него и вторични антитела (срещу диагностичен серум), белязани с ензим, и след това се добавят субстрат / хромоген за ензима.

Конкурентна ELISAза определяне на антигени: целевият антиген и ензим-маркираният антиген се конкурират помежду си за свързване на ограничен брой антитела на имунния серум.

Друг тест е конкурентна ELISA за определяне на антитела: целевите антитела и белязаните с ензими антитела се конкурират помежду си за антигени, адсорбирани върху твърдата фаза.

Имуноблотинг- високочувствителен метод за откриване на протеини, базиран на комбинация от електрофореза и ELISA или RIA. Имуноблотингът се използва като диагностичен метод за HIV инфекция и др.

Патогенните антигени се разделят чрез електрофореза в полиакриламиден гел, след това се прехвърлят от гела в активирана хартиена или нитроцелулозна мембрана и се развиват с помощта на ELISA. Фирмите произвеждат такива антигенни блот ленти. Серумът на пациента се прилага върху тези ленти. . След това, след инкубация, несвързаните антитела на пациента се отмиват и се прилага серумът срещу човешки имуноглобулини, белязан с ензима . Комплексът, образуван върху лентата [антиген + антитяло на пациента + антитяло срещу човешки Ig], се открива чрез добавяне на хромогенен субстрат, който променя цвета си под действието на ензим.