Il existe de nombreuses méthodes pour la détermination qualitative et quantitative des anticorps spécifiques du virus. En utilisant ces méthodes, il est possible de détecter simultanément les IgM et les IgG, ainsi que séparément les immunoglobulines de chaque classe. En règle générale, seules les IgG spécifiques du virus sont détectées dans la réaction de liaison du complément. Cependant, lors du test d'antigènes microbiologiques par cette méthode, il est possible de déterminer simultanément des IgM et des IgG spécifiques.

Les méthodes immunologiques sont utilisées principalement à deux fins : d'une part, pour diagnostiquer une infection virale en cours, terminée ou congénitale et, d'autre part, pour détecter des anticorps spécifiques dont la présence indique une infection passée et, par conséquent, une immunité contre une éventuelle réinfection. En termes de force de la réponse immunitaire à une infection virale, les gens sont très différents les uns des autres. En figue. 3 montre une courbe d'augmentation de titre typique

anticorps en réponse à la primo-infection rubéoleuse. Il est facile de voir que le diagnostic de rubéole est possible en augmentant le titre d'IgG spécifiques et en identifiant les IgM spécifiques. La présence d'IgM spécifiques dans le sang d'un nouveau-né indique une infection intra-utérine, car les IgM maternelles, contrairement aux IgG, sont retenues par le placenta. Les IgG spécifiques de l'infection primaire persistent généralement tout au long de la vie. Par conséquent, la présence d'anticorps de cette classe dans le sérum sanguin indique une immunité à la réinfection correspondante.

Vous trouverez ci-dessous des méthodes immunologiques pour détecter des anticorps spécifiques contre le virus de la rubéole, qui sont particulièrement efficaces pour diagnostiquer une maladie fœtale et déterminer le titre d'anticorps spécifiques dans le sérum sanguin. Descriptifs détaillés les méthodes utilisées pour diagnostiquer la rubéole peuvent être trouvées dans les revues de Pattison et Morgan-Kapner.

Réaction d'inhibition de l'hémagglutination

Le virus de la rubéole provoque l'hémagglutination des globules rouges chez de nombreuses espèces animales. Le plus souvent, les érythrocytes de poulets d'un jour sont utilisés en RTGA. Dans cette réaction, le virus cultivé en culture et traité avec du Tween 80 et de l'éther sert d'antigène hémagglutinant du virus de la rubéole. Le prétraitement augmente le titre HA du virus.

5.1.1 Standardisation de l'antigène HA du virus de la rubéole

1. 1 ml d'une suspension à 50 % d'érythrocytes de poulet est lavé trois fois dans du tampon Veronal avec du dextrane et de la gélatine par centrifugation et remise en suspension du sédiment dans un tube à centrifuger gradué de 15 ml. Les cellules lavées sont remises en suspension dans du tampon DGV pour obtenir une suspension à 30%.

Tableau 3. Préparation du tampon véronal avec du dextrane et de la gélatine

2. Diluer la préparation lyophilisée de l'antigène HA du virus de la rubéole dans le volume d'eau distillée requis conformément aux instructions.

3. Ajouter 1 volume de DGV à chacun des huit puits de deux rangées adjacentes d'une plaque de microtitrage en polystyrène à 96 puits avec des puits U-par-différents.

4. Dans les premiers puits de deux rangées, un volume d'antigène HA du virus de la rubéole est ajouté.

5. Des dilutions en série au double de l'antigène HA de la rubéole, allant de 1: 2 à 1: 256, sont préparées à l'aide d'un microtitre de 0,025 ml. Avant utilisation, la tête du micro-titreur doit être calcinée dans une flamme chauffée au rouge, puis refroidie pendant quelques secondes, placée dans de l'eau distillée et tamponnée avec du papier filtre.

6. Ajouter un volume supplémentaire de tampon DGV à chacun des puits remplis. A titre de contrôle, deux volumes de tampon DGV sont ajoutés dans les puits 12 des deux premières rangées.

7. La suspension d'érythrocytes lavés de poulets est diluée 100 fois avec du tampon DGV, obtenant ainsi une suspension à 0,03 %.

8. Dans l'ensemble des 18 puits ajouter deux volumes de suspension d'érythrocytes à 0,03 %, la plaque finie est recouverte d'une autre plaque non utilisée et incubée 1 heure à 4°C.

9. Une "plaque" dense d'érythrocytes non agglutinés se forme au fond des puits témoins. Les érythrocytes agglutinés se déposent uniformément. Le titre HA est considéré comme l'inverse de la dilution la plus élevée de l'antigène HA du virus de la rubéole, à laquelle une agglutination complète se produit encore. Cette dilution contient 1 unité hémagglutinante.

Pour tester les sérums, 4 unités GA d'antigène de la rubéole sont utilisées. Ainsi, si le titre d'antigène GA est de 32, alors pour détecter les anticorps contre le virus de la rubéole, il est dilué avec du DGV huit fois. L'antigène dilué est stable pendant 25-48 heures à 4°C.

5.1.2 Prétraitement du lactosérum

Tous les sérums contiennent des inhibiteurs d'hémagglutination non spécifiques qui doivent être éliminés. Les inhibiteurs non spécifiques de la GA sont principalement des lipoprotéines, qui sont libérées en traitant le sérum avec du kaolin. De plus, des agglutinines non spécifiques d'érythrocytes de poulet peuvent être présentes dans les sérums humains. Cependant, une adsorption préalable des sérums testés par les érythrocytes n'est pas nécessaire, puisque toutes les hémagglutinines non spécifiques présentes dans les sérums se retrouvent chez les témoins.

1. Dans des tubes à essai en verre numérotés, ajoutez 0,2 ml de sérum. En plus des sérums étudiés, des contrôles positifs et négatifs sont nécessaires dans chaque expérience.

2. Ajouter 0,8 ml de kaolin à 25 % dans un tampon borate salin dans chaque tube.

3. Le contenu des tubes est agité et laissé à température ambiante pendant 20 minutes.

4. Le kaolin épuisé est précipité par centrifugation dans une centrifugeuse de table à 2000 tr/min pendant 20 minutes.

5. Transférer le surnageant dans des tubes propres et numérotés. À la suite de la purification, le sérum est obtenu, dilué quatre fois. Ils sont utilisés pour formuler une réaction d'inhibition de l'hémagglutination. Les sérums peuvent être conservés à 4°C pendant la nuit.

5.1.3 Réaction d'inhibition de l'hémagglutination

1. Pour tester un échantillon de sérum, ajoutez un volume de DGV à une rangée de puits.

2. Ajouter un volume de sérum dilué quatre fois dans le premier et le dernier puits.

3. À l'aide d'un microtitre, préparer des dilutions séquentielles au double du sérum.

4. Un volume d'antigène GA de la rubéole contenant 4 GAU est ajouté aux puits 1-10. L'antigène GA de la rubéole n'est pas ajouté au puits 12.

5. Dans les puits 1 à 8 d'une autre plaque, un volume de la dilution de travail de l'antigène HA de la rubéole est ajouté, puis dans huit puits, des dilutions successives au double de l'antigène HA sont préparées. Un volume de DGV est ajouté à ces 16 puits. Ce titrage est un test pour l'antigène HA de la rubéole. Pour le contrôle, deux volumes de DGV sont ajoutés dans les puits 12 des première et deuxième rangées.

6. Les plaques couvertes sont laissées 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4°C.

7. Dans tous les puits remplis, deux volumes de suspension à 0,03 % d'érythrocytes de poulet sont ajoutés et les plaques sont laissées pendant 1 à 1,5 heures à 4°C.

8. En regardant les plaques, déterminer le titre d'antigène HA de la rubéole. Aucune agglutination ne doit se produire dans les puits témoins.

9. Si le sérum a agglutiné les érythrocytes en l'absence d'antigène GA de la rubéole, il est nécessaire de retester la dilution initiale du sérum. Au préalable, le sérum est adsorbé avec une goutte d'une suspension à 30% d'érythrocytes de poulet pendant 1 heure à température ambiante, puis les érythrocytes sont précipités par centrifugation.

10. Le titre d'anticorps spécifiques dans le sérum à tester est considéré comme l'inverse de la dilution, à laquelle l'hémagglutination est complètement supprimée.

5.1.4 Interprétation des résultats

Avec un titre faible, il est difficile d'interpréter les résultats, car avec une faible dilution, la présence résiduelle d'inhibiteurs non spécifiques est possible. La présence d'anticorps spécifiques du virus est considérée comme prouvée à un titre de 16 ou plus.

La réaction d'inhibition de l'hémagglutination (RTGA) est une méthode d'identification d'un virus ou de détection d'anticorps antiviraux dans le sérum sanguin du patient, basée sur le phénomène d'absence d'agglutination des érythrocytes par un médicament contenant un virus en présence de sérum immunisé contre celui-ci.

De nombreux virus ont la capacité d'agglutiner les érythrocytes d'espèces strictement définies de mammifères et d'oiseaux. Ainsi, les virus de la grippe et des oreillons agglutinent les érythrocytes des poulets, Cochons d'Inde, humains et adénovirus - érythrocytes de rats, souris. A cet égard, pour leur détection dans le matériel de patients ou dans des cultures de cellules, d'embryons et d'animaux, la réaction d'hémagglutination (RHA) est fixée. Pour cela, des dilutions doublement croissantes de matériel vacciné et de liquides sont préparées dans les puits des plaques, en y ajoutant des suspensions érythrocytaires de NaCl lavées avec une solution isotonique. Pour contrôler l'agglutination spontanée, les érythrocytes sont mélangés avec un volume égal de solution de NaCl isotonique. Les mélanges sont incubés dans un thermostat à 37°C ou à température ambiante.

Les résultats de RGA sont pris en compte par la nature de l'agglutination des érythrocytes après 30-60 minutes, quand ils sont généralement complètement précipités dans le contrôle. Les réactions positives sont indiquées par des plus. "++++" - sédiment en forme de "parapluie", "+++" - sédiment avec des lacunes, "++" - sédiment avec de grandes lacunes, "+" - sédiment floconneux entouré d'une zone d'érythrocytes froissés , et "-" - le même sédiment d'érythrocytes aux contours nets sous la forme d'un "bouton", comme dans le contrôle.

Étant spécifique à un groupe, la RHA ne permet pas de déterminer l'espèce d'appartenance des virus. Ils sont identifiés à l'aide de la réaction d'inhibition de l'hémagglutination (HAI). Pour sa fixation, on utilise des sérums antiviraux immuns connus, qui sont dilués dans une solution isotonique de chlorure de sodium à des concentrations décroissantes deux fois et versés dans les puits. Une quantité égale de liquide vacciné est ajoutée à chacune de leurs dilutions. Le témoin est une suspension du virus dans une solution isotonique de chlorure de sodium. Des plaques avec un mélange de sérums et de virus sont maintenues au thermostat pendant 30 minutes ou à température ambiante pendant 2 heures, puis une suspension d'érythrocytes est ajoutée à chacune d'elles. Après 30 minutes, le titre du sérum neutralisant (c'est-à-dire sa dilution maximale), qui a provoqué un retard dans l'agglutination des érythrocytes, est déterminé.

Le RTGA est utilisé dans le diagnostic sérologique des maladies virales, en particulier la grippe et les infections à adénovirus. Il vaut mieux le mettre de la même manière que PH, avec des sérums appariés. Une multiplication par quatre du titre d'anticorps dans le second sérum confirme le diagnostic de présomption.

La réaction d'inhibition de l'hémagglutination (RTGA) est basée sur le blocage, la suppression des antigènes viraux par les anticorps de l'immunsérum, à la suite de laquelle les virus perdent leur capacité à agglutiner les érythrocytes.

Le RTGA est utilisé pour diagnostiquer de nombreuses maladies virales dont les agents responsables (virus de la grippe, de la rougeole, de la rubéole, de l'encéphalite à tiques, etc.) peuvent agglutiner les érythrocytes de divers animaux.

Mécanisme. Le typage du virus est réalisé dans la réaction d'inhibition de l'hémagglutination (RTGA) avec un ensemble de sérums spécifiques de type. Les résultats de la réaction sont pris en compte pour l'absence d'hémagglutination. Les sous-types de virus A avec les antigènes H 0 N 1, H 1 N 1, H 2 N 2, H 3 N 2, etc. peuvent être différenciés en RTGA avec un ensemble de sérums homologues spécifiques au type.

Récemment, la réaction a été largement utilisée dans les laboratoires de virologie clinique pour déterminer les titres d'anticorps spécifiques à certains virus, ainsi que pour l'identification sérologique et le typage d'isolats de virus à partir de matériel clinique de patients. Leur utilisation est quelque peu limitée en raison de la présence d'inhibiteurs non spécifiques de virus dans le sérum sanguin des personnes, ainsi que d'anticorps naturels - les agglutinines.

Principe RTGA consiste à mélanger des volumes égaux de sérum sanguin et de suspension virale dans un tube à essai, et après exposition on détermine si le virus est conservé dans le mélange en ajoutant une suspension d'érythrocytes. L'agglutination des érythrocytes indique la présence et l'absence d'hémagglutination indique l'absence d'un virus dans le mélange. La disparition du virus du mélange virus + sérum est considérée comme un signe de l'interaction des anticorps sériques et du virus.

Mais les anticorps interagissent avec les antigènes dans des rapports quantitatifs strictement définis. Par conséquent, pour qu'une certaine quantité de virus soit privée de la capacité d'hémagglutination, un certain minimum d'anticorps est nécessaire, et comme l'un des composants du RTGA est toujours inconnu, il est nécessaire de mettre la réaction dans une rangée de tubes à essai avec différentes doses d'anticorps et les mêmes doses de virus, ou vice versa. Ceci est réalisé en prenant soit différentes dilutions de sérum et la même dilution de virus, soit différentes dilutions de virus et la même dilution de sérum.

La RTGA permet de résoudre les tâches suivantes : déterminer le titre d'anticorps contre le virus hémagglutinant dans le sérum ; identifier un virus hémagglutinant inconnu par des sérums connus; pour établir le degré de relation antigénique de deux virus.

Avantages du RTGA : simplicité de la technologie, rapidité, aucun travail stérile n'est requis, spécificité, faible coût. Inconvénient : la RTGA n'est possible qu'avec des virus hémagglutinants.

Principe de titrage des anticorps en RTGA est comme suit:

- préparer une série de dilutions séquentielles (généralement 2 fois) du sérum à tester en volumes égaux (généralement 0,25 ou 0,2 ml) ;

- à chaque dilution ajouter les mêmes volumes de virus homologue à un titre de 4 HAU ;

- les mélanges sont conservés un certain temps à une certaine température (pour le virus de la maladie de Newcastle 40-60 minutes à température ambiante) ;

- des volumes égaux d'une suspension à 1 % d'érythrocytes lavés sont ajoutés à tous les mélanges ;

- après exposition, évaluer l'hémagglutination dans chaque mélange en croisement.

La réaction comprend des contrôles pour le sérum, le virus et les érythrocytes.

La dilution de sérum la plus élevée, qui inhibe encore complètement l'hémagglutination, est prise comme indicateur du titre d'anticorps dans ce sérum.

Utilisation des réactions d'hémadsorption en virologie.

RGAD. L'hémadsorption - la connexion des érythrocytes avec la surface des cellules affectées par le virus - a été découverte pour la première fois par Vogel et Shchelokov (1957) sur une culture tissulaire infectée par le virus de la grippe. Ce phénomène est basé sur la relation des récepteurs viraux situés à la surface de la cellule affectée avec les récepteurs érythrocytaires, ce qui conduit à leur adhésion mutuelle similaire à la réaction d'hémagglutination. L'avantage de cette réaction est qu'elle devient positive avant même l'apparition de changements cytopathiques distincts dans les cellules infectées.

Méthodologie RGAD est comme suit. Le 3-4ème jour après l'infection des cellules, prélever deux tubes avec la même culture de cellules, dont l'un est infecté avec du matériel vacciné et le second est un témoin. Le liquide de culture est drainé des deux tubes à essai et 2-3 gouttes d'une suspension à 0,5% d'érythrocytes lavés sont ajoutées aux deux. Les deux tubes sont laissés pendant 5 à 10 minutes pour que les érythrocytes soient à la surface des cellules (placés horizontalement sur la table), puis ils sont légèrement rincés avec une solution saline et examinés au microscope (faible grossissement). Dans le tube de contrôle, les érythrocytes sont complètement éliminés avec une solution saline et certains des autres flottent avec le liquide. Si dans un tube à essai infecté, les érythrocytes ne sont pas éliminés avec une solution saline et ne flottent pas, mais sont attachés à la surface des cellules, le RHAD doit être considéré comme positif.

Selon le virus et le type de cellules, la localisation des globules rouges peut être triple :

- les érythrocytes ne sont adsorbés que le long de la périphérie de la couche cellulaire sous la forme d'un « collier » (virus de la peste porcine africaine) ;

- les érythrocytes sont localisés sur la couche cellulaire en foyers ou en amas (virus de la grippe) ;

- les érythrocytes sont localisés de manière diffuse sur la couche cellulaire (virus parainfluenza).

Chaque virus est capable d'adsorber les globules rouges de certains types d'animaux.

Diagnostic sérologique des maladies virales basé sur l'augmentation du titre d'anticorps dans des sérums sanguins appariés.

Réaction d'hémagglutination (RHA) et réaction d'inhibition de l'hémagglutination (RTGA), mécanisme, composants et application des réactions.

La réaction d'hémagglutination est basée sur le phénomène d'adhésion des érythrocytes, qui se produit sous l'influence de divers facteurs. Distinguer hémagglutination directe et indirecte.

Tout d'abord, les érythrocytes sont lavés avec une solution de chlorure de sodium isotonique, puis, si nécessaire (lors de l'utilisation d'antigènes de nature protéique), ils sont traités avec une solution de tanin 1: 20 000 et sensibilisés avec des antigènes solubles. Après lavage avec une solution tamponnée de chlorure de sodium isotonique, l'antigène érythrocytaire est prêt à l'emploi.

Les sérums étudiés sont dilués avec une solution isotonique de chlorure de sodium dans des tubes à essai ou des plaques en plastique spéciales avec des puits, puis un diagnostic d'érythrocytes est ajouté à chaque dilution de sérum. Les résultats de la réaction d'hémagglutination indirecte sont pris en compte par la nature du sédiment érythrocytaire formé au fond de l'éprouvette. Le résultat de la réaction est considéré comme positif, dans lequel les globules rouges recouvrent uniformément tout le fond du tube à essai. En cas de réaction négative, des érythrocytes en forme de petit disque ou "bouton" sont situés au centre du fond du tube à essai

Les principaux composants du RP :

A) antigène soluble,

B) Anticorps spécifiques (sérum)

(RTGA) est une méthode d'identification d'un virus ou de détection d'anticorps antiviraux dans le sérum sanguin d'un patient, basée sur le phénomène d'absence d'agglutination des érythrocytes par une préparation contenant un virus en présence de sérum immun contre celui-ci.
basé sur le blocage, la suppression des antigènes des virus par les anticorps de l'immunsérum, à la suite de laquelle les virus perdent leur capacité à agglutiner les érythrocytes.

Le RTGA est utilisé pour diagnostiquer de nombreuses maladies virales dont les agents responsables (virus de la grippe, de la rougeole, de la rubéole, de l'encéphalite à tiques, etc.) peuvent agglutiner les érythrocytes de divers animaux.
Mécanisme. Le typage du virus est réalisé dans la réaction d'inhibition de l'hémagglutination (RTGA) avec un ensemble de sérums spécifiques de type. Les résultats de la réaction sont pris en compte pour l'absence d'hémagglutination. Sous-types de virus A avec les antigènes H0N1, H1N1, H2N2, H3N2, etc.

peuvent être différenciés en RTGA avec un ensemble de sérums homologues spécifiques au type.

Au coeur de réactions d'hémagglutination réside le phénomène d'adhésion des érythrocytes, qui se produit sous l'influence de divers facteurs.

Distinguer hémagglutination directe et indirecte.
Dans la réaction d'hémagglutination directe, les érythrocytes se collent lorsque certains antigènes, tels que les virus, sont adsorbés sur eux.
Dans les études sérologiques, une réaction directe d'inhibition de l'hémagglutination est utilisée, lorsqu'un virus isolé d'un patient est neutralisé avec un immunsérum spécifique, puis associé à des érythrocytes.

L'absence d'hémagglutination indique la correspondance du virus et de l'immunsérum utilisé.

La réaction d'hémagglutination indirecte (hémagglutination passive) est observée dans les cas où l'immunsérum ou le sérum du patient ayant les anticorps correspondants est ajouté aux érythrocytes préalablement traités (sensibilisés) avec divers antigènes.

Il existe un collage spécifique des érythrocytes, leur hémagglutination passive.

La réaction d'hémagglutination indirecte ou passive en sensibilité et en spécificité est supérieure aux autres méthodes sérologiques et elle est utilisée dans le diagnostic des infections causées par des bactéries, des rickettsies, des protozoaires.

La technique de mise en scène de la réaction d'hémagglutination indirecte comprend plusieurs étapes.

Tout d'abord, les érythrocytes sont lavés avec une solution de chlorure de sodium isotonique, puis, si nécessaire (lors de l'utilisation d'antigènes de nature protéique), ils sont traités avec une solution de tanin 1: 20 000 et sensibilisés avec des antigènes solubles.

Après lavage avec une solution tamponnée de chlorure de sodium isotonique, l'antigène érythrocytaire est prêt à l'emploi. Les sérums étudiés sont dilués avec une solution isotonique de chlorure de sodium dans des tubes à essai ou des plaques en plastique spéciales à puits, puis des érythrocytes diagnosticum sont ajoutés à chaque dilution de sérum.

Les résultats de la réaction d'hémagglutination indirecte sont pris en compte par la nature du sédiment érythrocytaire formé au fond de l'éprouvette. Le résultat de la réaction est considéré comme positif, dans lequel les globules rouges recouvrent uniformément tout le fond du tube à essai. Si la réaction est négative, des globules rouges sous la forme d'un petit disque ou "bouton" sont situés au centre du fond du tube à essai.

Réaction d'inhibition de l'hémagglutination- une réaction sérologique basée sur la capacité des anticorps à empêcher l'agglutination des érythrocytes par des virus hémagglutinants (adénovirus, arbovirus, certains entérovirus, virus grippaux et parainfluenza, rougeole, réovirus).

Des anticorps antiviraux spécifiques interagissent avec les molécules d'hémagglutinine de surface des virions de ces virus et bloquent leur liaison aux molécules complémentaires de la membrane érythrocytaire.

Récemment, la réaction a été largement utilisée dans les laboratoires de virologie clinique pour déterminer les titres d'anticorps spécifiques à certains virus, ainsi que pour l'identification sérologique et le typage d'isolats de virus à partir de matériel clinique de patients.

Leur utilisation est quelque peu limitée en raison de la présence d'inhibiteurs non spécifiques de virus dans le sérum sanguin des personnes, ainsi que d'anticorps naturels - les agglutinines.

La réaction de neutralisation est une réaction d'inhibition de l'hémagglutination (RTGA).

RTGA est appliqué :
-pour le sérotypage des virus ;
- pour le sérodiagnostic des infections.
Il existe deux modes de mise en scène :
- méthode goutte à goutte sur verre (réaction approximative), utilisée pour la copie grise des virus ;
- déplié dans des tubes à essai.

Mécanisme.

Certains virus (par exemple, la grippe) contiennent de l'hémagglutinine, qui provoque l'agglutination des globules rouges chez différents animaux, selon le type de virus.

En présence d'anticorps dans le sérum - antihémagglutinines, une inhibition de l'activité des virus est observée.
RTGA.
Objectif : Sérotypage du virus de la grippe A

Composants:
1. Matériel de test - liquide allantoïdien d'un embryon de poulet,
2. Sérum antigrippal de type diagnostique spécifique,
Suspension à 3,5 % d'érythrocytes de poulet.
4.

Saline.

La réaction est mise sur le verre par la méthode de la goutte. Appliquer 1 goutte de sérum de diagnostic et de matériel de test sur le verre, mélanger, puis ajouter 1 goutte de suspension d'érythrocytes. Avec une réaction positive, une rougeur homogène est observée et avec une réaction négative, des flocons rouges tombent (hémagglutination).

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Caractérisation des virus grippaux. Epidémiologie et diagnostic de la grippe. Utilisation du RTGA pour le sérotypage des virus grippaux. Préparations pour la prophylaxie et le traitement spécifiques.

Grippe ou Influenza - Aiguë infection caractérisé par des lésions des muqueuses de la partie supérieure voies respiratoires, fièvre, intoxication générale, altération de l'activité des systèmes cardiovasculaire et nerveux.

La grippe se caractérise par une tendance à la propagation épidémique et pandémique en raison de la forte contagiosité et de la variabilité de l'agent pathogène.

Caractéristiques des agents pathogènes. Les agents pathogènes - les virus de la grippe en font partie. Orthomyxoviridae, les genres Influenzavirus A, B et Influenzavirus C. Les virus de la grippe sont des virus à ARN. Le virus de la grippe de type A a été isolé en 1933 par W. Smith, K. Andrews, P. Laidlaw. En 1940, T.

Application de la méthode d'hémagglutination en virologie.

Francis et R. Medgill ont isolé les virus de la grippe de type B, en 1949 R. Taylor - type C. En Russie, les premiers virus de la grippe ont été isolés en 1936 par A. A. Smorodintsev et classés comme type A. Morphologie. Les virus de la grippe ont une forme sphérique (forme de boule) - 80 - 120 nm, moins souvent ils ont une forme filamenteuse. Ils se composent de : 1) un noyau - une nucléocapside de symétrie de type spirale (chaîne "-" linéaire simple brin d'ARN + protéine capside); 2) membrane basale - membrane lipoprotéique externe - supercapside.

À la surface de l'enveloppe, il existe 2 types de glycoprotéines (sous forme d'épines et de villosités): 1) l'hémagglutinine - favorise l'attachement aux récepteurs cellulaires; 2) neuraminidase - favorise la libération du virus de la cellule. Cultivation. Des embryons de poulet, des cultures cellulaires primaires trypsinisées et parfois des animaux de laboratoire sont utilisés pour la culture.

Le modèle le plus pratique est celui des embryons de poulet âgés de 10 à 12 jours. Il vous permet d'obtenir de grandes quantités de virus, ce qui est nécessaire à la production de vaccins et de préparations bactériennes.

L'infection est réalisée dans la cavité allontoïque, dans la membrane chorion-allontoïque, dans la cavité amniotique, dans l'amnios. La présence du virus dans l'embryon de poulet est détectée dans la réaction d'hémagglutination. Structure antigénique. Les virus ont un antigène interne - S et des antigènes de surface : HA-hémagglutinine et NA-neuraminidase. L'antigène S est spécifique à un groupe, commun à l'ensemble du type, car cet antigène, les virus de la grippe sont divisés en types A, B et C. Il s'agit d'un antigène stable (immuable) se liant au complément.

Les antigènes HA et NA sont des antigènes spécifiques. L'antigène HA provoque la formation d'anticorps neutralisant le virus et l'adhésion des érythrocytes.

L'antigène NA provoque la formation d'anticorps qui neutralisent partiellement les virus.

Le virus de type B est moins variable et le type C est très stable.

Propriétés toxiques. L'effet toxique du virus sur le corps ( mal de tête, douleur musculaire, température, phénomènes catarrhaux) est causée par les protéines du virus (la particule la plus virale). Cette action est strictement spécifique et n'est neutralisée que par l'immunsérum du type ou sous-type correspondant ou par le sérum des malades. La résistance. Les virus de la grippe sont sensibles aux rayons UV, aux désinfectants (formol, alcool, phénol, chloramines) et aux solvants gras.

En milieu liquide, ils meurent à une température de 50 - 60°C en quelques minutes. A température ambiante dans l'air, les virus restent infectieux pendant plusieurs heures. Ils se conservent longtemps sous forme séchée et à l'état congelé (-70 ° C), non seulement ils persistent longtemps, mais ne perdent pas non plus en virulence.

La susceptibilité des animaux. Dans des conditions naturelles, les virus de type A infectent les humains et les animaux (chevaux, porcs tombent malades) et les virus de types B et C - uniquement les humains. Parmi les animaux de laboratoire, les souris blanches, les furets africains, les hamsters syriens et les singes sont sensibles aux virus.

La maladie chez les animaux se caractérise par des lésions pulmonaires, un état fébrile et peut entraîner la mort des animaux. Epidémiologie de la maladie. La source de l'infection est une personne malade présentant une forme cliniquement exprimée ou asymptomatique. Une personne malade libère le virus dans l'environnement lorsqu'elle tousse, parle, éternue avec des gouttes de salive, de mucus, d'expectorations déjà pendant la période d'incubation.

Le patient devient contagieux 24 heures avant l'apparition des principaux symptômes et présente un danger épidémique dans les 48 heures suivant leur disparition.

Le mécanisme de transmission est aérogène. La voie de transmission est aérienne. Les gens sont très sensibles à la grippe. Tous les groupes d'âge sont malades, principalement en hiver. Les plus sensibles sont les enfants et les personnes âgées. Le nom de la maladie reflète les caractéristiques de l'épidémiologie : grippe du français. pince - à saisir, grippe - de l'italien. Influenza di freddo - l'influence du froid.

De tous les pointus maladies respiratoires la grippe est la maladie la plus répandue et la plus grave. Les pandémies et épidémies de grippe couvrent jusqu'à 30 à 50 % ou plus de la population mondiale, causant d'énormes dommages à la santé et à l'économie des pays. Les premières descriptions d'épidémies de grippe remontent au XIIe-XIVe siècle. L'émergence de pandémies et d'épidémies majeures est causée par le virus de la grippe de type A, qui est dû à la grande variabilité du virus et est associé à l'émergence d'un nouveau sous-type en raison du changement d'antigène.

Entre les pandémies, des flambées épidémiques surviennent tous les 1,5 à 2 ans, ce qui est associé à une dérive antigénique des virus. En 1918, la pandémie de grippe espagnole (1,5 milliard de personnes sont tombées malades, 20 millions sont décédées) a été causée par le virus de la grippe A1. Principalement enregistrée en Espagne, cette pandémie a touché la quasi-totalité de la population de la Terre ; la maladie était caractérisée par le développement d'une pneumonie hémorragique extrêmement sévère avec un taux de mortalité record (jusqu'à 1% de tous les cas).

En 1957, la pandémie "asiatique" (2 milliards de personnes sont tombées malades) a été causée par un nouveau sous-type - le sous-type A2. En 1968, la pandémie de "Hong Kong" (1 milliard de personnes sont tombées malades) a été causée par un sous-type nouvellement apparu - le sous-type A3. En règle générale, une nouvelle variante du virus déplace une variété antérieure en circulation de la population humaine.

Mais en 1977, après une interruption de 20 ans, le type A1 est soudainement « revenu », entraînant une épidémie majeure. Par conséquent, les variantes déplacées du virus de la grippe persistent et à certains intervalles peuvent provoquer à nouveau une épidémie. Le virus de type B provoque des épidémies locales et le type C ne provoque pas d'épidémies. Pathogenèse et tableau clinique de la maladie. La porte d'entrée est la voie aérienne supérieure. Le virus envahit les cellules épithéliales de la membrane muqueuse et s'y multiplie.

L'effet du virus sur les cellules épithéliales provoque leur nécrose et leur desquamation (rejet) de l'épithélium, à la suite de quoi la membrane muqueuse devient perméable aux virus et aux bactéries. Ils pénètrent dans la circulation sanguine et se propagent dans tout le corps. » La virémie s'accompagne de multiples lésions de l'endothélium capillaire avec une augmentation de leur perméabilité.

Dans les cas graves, il existe des hémorragies étendues dans les poumons, le myocarde, les organes parenchymateux. Les produits de désintégration des cellules endommagées et des protéines virales ont un effet toxique sur divers organes et systèmes organiques. Les toxines du virus inhibent fortement le système nerveux central et, bien que le processus ne dure pas longtemps (3 à 5 jours), la personne malade reste affaiblie longtemps et une infection secondaire rejoint le corps affaibli et des complications surviennent : grippe pneumonie, œdème pulmonaire aigu, lésions rénales, cœur, bronches.

Une complication courante de la grippe est la pneumonie bactérienne (streptocoques du groupe B). Pendant la pandémie de grippe espagnole, les gens sont morts principalement de pneumonie bactérienne secondaire.

Dans la pathogenèse de la grippe, non seulement l'intoxication est importante, mais également l'allergisation, ainsi qu'une violation des propriétés fonctionnelles des cellules immunitaires avec le développement d'une immunodéficience. Période d'incubation- plusieurs heures - 1-3 jours. Caractérisé par un début aigu, une augmentation de la température à 37,5 - 38 ° C, une intoxication générale, exprimée en malaise, mal de tête, douleur en globes oculaires, processus inflammatoires des voies respiratoires de gravité variable (rhinite, laryngite, trachéite, pharyngite).

La fièvre avec grippe sans complications dure 5 à 6 jours. Immunité. Après la maladie transférée, une immunité spécifique au type et à la souche est formée, qui est fournie par des facteurs cellulaires et humoraux spécifiques et non spécifiques. Les anticorps Ig A sont d'une grande importance. L'immunité croisée ne se développe pas, après le transfert de la grippe de type A1, vous pouvez tomber malade avec la grippe de type A2, etc. Après le virus de type, l'immunité est de 1 à 2 ans, après le virus de type B de 3 à 5 ans.

Immunité naturelle passive - chez les enfants de moins de 8 à 11 mois. En raison de la forte variabilité antigénique du virus, la guérison ne conduit pas au développement d'une résistance persistante aux infections répétées.

Diagnostic de laboratoire. Matériel de test: frottis-empreintes de la membrane muqueuse de la cavité nasale, écoulement du nasopharynx, morceaux de poumons, cerveau en cas de décès.

Méthodes de diagnostic: 1) méthode de cytoroscopie - détection d'inclusions intracellulaires spécifiques au virus - lorsqu'elles sont colorées à la pioctanine au microscope, des inclusions rouge vif du virus de la grippe dans les cellules de l'épithélium ciliaire sont visibles; 2) méthode virologique - l'isolement du virus de la grippe du corps humain en infectant des embryons de poulet par lavage du nasopharynx du patient; l'indication (présence) du virus est réalisée à l'aide des RHA (les virus grippaux agglutinent les érythrocytes de l'homme et de divers animaux), l'identification du virus est réalisée par étapes : le type est déterminé dans le RSC, le sous-type hémagglutinine - dans le RTGA, et le sous-type neuraminidase - dans la réaction d'inhibition de l'activité enzymatique ; 3) méthode sérologique - détection d'une augmentation du titre (4 fois) d'anticorps spécifiques dans le sérum du patient en utilisant RSK, RTGA, PH en culture cellulaire, réaction de précipitation en gel, ELISA; 4) méthode biologique - infection intranasale de souris - introduction de matériel dans les poumons sous anesthésie à l'éther; les souris meurent après 2 à 3 jours des suites d'une pneumonie ; 5) diagnostics express - détection de l'antigène viral à l'aide de RIF.

Traitement et prévention.

Pour la prévention et le traitement dans les premiers jours de la maladie, l'interféron leucocytaire humain est utilisé (par voie intranasale). V à des fins médicinales utilisation médicaments antiviraux- remantadine (grippe de type A), adapromine, virazole et médicaments immunomodulateurs - dibazol, prodigiosan, lévomizole.

Dans la grippe sévère, en particulier chez les enfants, l'immunoglobuline anti-grippale du donneur est utilisée, ainsi que des médicaments - inhibiteurs des protéases cellulaires (gordox, contrikal, acide aminocaproïque).

Prophylaxie spéciale. Les médicaments antiviraux et immunomodulateurs suivants sont utilisés, ainsi que les vaccins - vivants et inactivés : 1) monovaccins vivants pour administration orale - souches atténuées de virus circulant actuellement (A1, A3 et B) ; montrer la plus grande immunogénicité; 2) des vaccins à virions entiers issus de souches virulentes inactivées par le formaldéhyde ou les rayons UV ; 3) vaccins antigrippaux sous-unitaires uniquement à partir d'antigènes de surface - antigènes HA et NA (ont une réactogénicité minimale).

Pour obtenir des vaccins, des virus sont cultivés dans des embryons de poulet et dans une culture cellulaire d'embryons de poulet.

Avec l'introduction des vaccins, une immunité locale et humorale se forme. La vaccination est effectuée pendant les périodes de plus grand risque épidémique. Il est surtout indiqué pour les jeunes et les personnes âgées. L'utilisation de vaccins tués nécessite une revaccination annuelle ; leur efficacité ne dépasse pas 60 - 70%.

Parce que Etant donné que des variations antigéniques de l'agent pathogène sont souvent observées, l'ensemble d'antigènes du virus correspondant pour l'immunisation ne peut être déterminé qu'après le début d'une épidémie.

Billet 15.

Réaction d'hémagglutination (RHA).

En laboratoire, ils utilisent deux réactions d'hémagglutination dont le mécanisme d'action diffère.

Le premier RHA est sérologique. Dans cette réaction, les globules rouges s'agglutinent lorsqu'ils interagissent avec les anticorps correspondants (hémagglutinines).

La réaction est largement utilisée pour déterminer les groupes sanguins.

Le deuxième RHA n'est pas sérologique. Dans celui-ci, l'adhésion des érythrocytes n'est pas causée

des anticorps et des substances spéciales formées par des virus. Par exemple, le virus de la grippe agglutine les érythrocytes des poulets et des cobayes, le virus de la poliomyélite - les érythrocytes des moutons. Cette réaction permet de juger de la présence d'un virus particulier dans le matériel à tester.

La réaction est effectuée dans des tubes à essai ou sur des plaques spéciales avec des trous.

Le matériel à tester pour la présence du virus est dilué avec une solution isotonique de 1:10 à 1:1280 ; 0,5 ml de chaque dilution est mélangé avec un volume égal de suspension d'érythrocytes à 1-2%. Dans le témoin, 0,5 ml d'érythrocytes sont mélangés à 0,5 ml de solution isotonique. Les tubes sont placés dans un thermostat pendant 30 minutes, et les plaques sont laissées à température ambiante pendant 45 minutes.

Comptabilisation des résultats.À résultat positif réaction au fond du tube à essai ou du puits, un précipité d'érythrocytes à bords festonnés ("parapluie") tombe, recouvrant tout le fond du puits.

Réaction d'inhibition de l'hémagglutination

Si le résultat est négatif, les érythrocytes forment un sédiment dense aux bords lisses ("bouton"). Le même sédiment devrait être sous contrôle.

L'intensité de la réaction est exprimée par des signes "+". Le titre du virus est la dilution maximale du matériel dans lequel se produit l'agglutination.

Réaction d'inhibition de l'hémagglutination

Il s'agit d'une réaction sérologique dans laquelle des anticorps antiviraux spécifiques, interagissant avec un virus (antigène), le neutralisent et le privent de la capacité d'agglutiner les érythrocytes, c'est-à-dire

C'est-à-dire qu'ils inhibent la réaction d'hémagglutination. Cette réaction vous permet de déterminer le type et le type de virus.

Énoncé de la réaction. 0,25 ml de sérum antiviral est mélangé à un volume égal de matériel contenant le virus. Le mélange est agité et placé dans un thermostat pendant 30 minutes, après quoi 0,5 ml'1-2 % de suspension d'érythrocytes sont ajoutés.

Comptabilisation des résultats. Avec le réglage correct de l'expérience dans le contrôle du sérum et des érythrocytes, un "bouton" doit être formé - il n'y a pas de facteur agglutinant les érythrocytes; dans le contrôle de l'antigène, un "parapluie" se forme - le virus a provoqué l'agglutination des érythrocytes.

Si le sérum est homologue au virus étudié, un "bouton" se forme - le sérum a neutralisé le virus.

Réaction d'hémagglutination indirecte

La réaction d'hémagglutination indirecte (passive) (RIGA) est basée sur le fait que les érythrocytes, si un antigène soluble est adsorbé à leur surface, acquièrent la capacité de s'agglutiner lorsqu'ils interagissent avec des anticorps dirigés contre l'antigène adsorbé.

Énoncé de la réaction.

Le sérum est chauffé pendant 30 minutes à 56 ° C, dilué séquentiellement dans un rapport de 1:10 - 1:1280 et versé dans des tubes ou puits de 0,25 ml, où sont ensuite ajoutées 2 gouttes d'érythrocytes sur lesquels sont adsorbés les antigènes.

Les contrôles: une suspension d'érythrocytes avec des antigènes adsorbés sur eux avec du sérum évidemment immun, une suspension d'érythrocytes avec des antigènes adsorbés sur eux avec du sérum normal ; suspension d'érythrocytes normaux avec le sérum testé.

Dans le premier contrôle, l'agglutination devrait se produire, dans le deuxième et le troisième, elle ne devrait pas l'être.

Questions de contrôle.

1. Qu'indique un résultat RHA positif entre les érythrocytes et le matériel testé pour la présence du virus ?

2. La réaction d'agglutination des érythrocytes se produira-t-elle si le virus et le sérum correspondant y sont ajoutés ?

Comment s'appelle la réaction qui révèle ce phénomène ?

TRAVAIL PRATIQUE N° 12.

Réaction de liaison du complément.

La réaction de liaison du complément (CSC) est basée sur le fait qu'un complexe antigène-anticorps spécifique adsorbe (se lie) toujours le complément sur lui-même.

Cette réaction est largement utilisée dans l'identification d'antigènes et dans le sérodiagnostic des infections, en particulier des maladies causées par les spirochètes (réaction de Wasserman), les rickettsies et les virus.

Réaction sérologique RCC-complexe.

Elle implique le complément et deux systèmes antigène-anticorps. Il s'agit essentiellement de deux réactions sérologiques.

Le bon système - le principal - est constitué d'un antigène et d'un anticorps (l'un est connu, l'autre pas). On y ajoute une certaine quantité de complément. Lorsque l'antigène et les anticorps de ce système correspondent, ils se combinent et se lient au compliment. Le complexe formé est finement dispersé et non visible.

La formation de ce complexe est reconnue à l'aide d'un second système hémolytique ou indicateur.

Il comprend les érythrocytes de mouton (antigène) et le sérum hémolytique correspondant (anticorps), c'est-à-dire complexe immunitaire prêt à l'emploi. Dans ce système, la lyse des globules rouges ne peut se produire qu'en présence de complément. Si le complément est lié par le premier système, alors il n'y aura pas d'hémolyse dans le second système ;

pas de complément gratuit. L'absence d'hémolyse (le contenu du tube est trouble ou au fond de son sédiment d'érythrocytes) est enregistrée comme un résultat positif de CSC.

Si dans le premier système l'antigène ne correspond pas à l'anticorps, alors le complexe immun ne se forme pas et le compliment restera libre. Restant libre, le compliment participe au second système, provoquant une hémolyse, le résultat CSC est négatif (le contenu des tubes est transparent "sang laqué").

Composants, complément des réactions de liaison :

Antigène - généralement lysat, extrait, haptène,

moins souvent une suspension de micro-organismes.

2. Anticorps - sérum du patient.

3. Complément - sérum de cobaye.

Antigène - érythrocytes de mouton.

5. Anticorps - hémolysine contre les érythrocytes de mouton.

6. Solution isotonique.

En raison du fait qu'un grand nombre de composants complexes sont impliqués dans la DGC,

ils doivent être pré-titrés et introduits dans la réaction en quantités exactes et en volumes égaux : 0,5 ou 0,25 chacun, moins souvent 0,2.1.25 ou 1,0 ml (de grands volumes donnent un résultat plus précis). Le titrage des composants de la réaction est effectué dans le même volume que l'expérience, en remplaçant les ingrédients manquants par une solution isotonique.

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Basé sur le fait que les érythrocytes, sur lesquels les antigènes sont préalablement adsorbés, acquièrent la capacité de s'agglutiner en présence de sérums homologues (anticorps).

Dans ce cas, les érythrocytes agissent comme porteurs de déterminants spécifiques, dont l'agglutination résulte de la réaction antigène + anticorps.

Les érythrocytes, à la surface desquels les antigènes sont fermement attachés, sont appelés érythrocytes antigéniques diagnosticum, ou érythrocytes sensibilisés avec un antigène.

Un autre type de RNGA - les anticorps sont adsorbés à la surface des érythrocytes et leur agglutination ultérieure se produit en présence d'un antigène homologue.

Dans ce cas, ces érythrocytes sont appelés érythrocytes anticorps diagnosticum, ou érythrocytes sensibilisés avec des anticorps.

Sur la base de ces deux approches méthodologiques fondamentales, de nombreuses modifications du RNGA ont été développées et sont utilisées. Ainsi, de petites particules de latex standard sont utilisées comme supports.

Réaction d'inhibition de l'hémagglutination (RTGA)

Dans ce cas, la réaction est appelée réaction d'agglutination au latex (RLA) ou Staphylococcus aureus est utilisé - réaction de coagglutination, etc. Habituellement, les diagnostics érythrocytaires sont préparés dans les entreprises de l'industrie biologique et, dans les laboratoires de diagnostic, ils mettent déjà le principal expérience du RNGA.

La préparation du diagnostic érythrocytaire comprend les étapes suivantes :

• fixation des érythrocytes avec du formaldéhyde ou du glutaral, ou des aldéhydes acryliques.

  De tels érythrocytes traités persistent longtemps. Le plus souvent, des érythrocytes de bélier, d'humains, de poulets, etc. sont utilisés à cette fin ;

• traitement des érythrocytes fixés avec une solution de tanin. De ce fait, les érythrocytes acquièrent la propriété d'adsorber de manière irréversible les protéines (virus et anticorps) à leur surface ;
• sensibilisation des érythrocytes bronzés avec des virus ou des anticorps.

Il convient de noter que les méthodes de préparation des diagnostics érythrocytaires pour les infections virales sont différentes.

La technique de réglage du RNGA pour la détection et la détermination du titre d'anticorps est la suivante :

• des doses égales d'érythrocytes sensibilisés à l'antigène sont ajoutées à des dilutions en série de 2 fois de sérum;
• le mélange est laissé 2-3 heures à température ambiante ou pendant 16-18 heures à 4°C ;
• tenir compte des résultats.

  Si le sérum contient des anticorps contre le virus, qui ont sensibilisé les érythrocytes, une hémagglutination est observée, qui est évaluée en croisements.

Pour le titre d'anticorps dans le sérum, la dilution de sérum la plus élevée est prise, ce qui permet encore une hémagglutination par au moins deux croisements.

Le RNGA est accompagné de tous les contrôles pertinents. Habituellement, la réaction est effectuée par la microméthode.

RNGA vous permet de résoudre les tâches de diagnostic suivantes :

• détecter les anticorps et déterminer leur titre dans le sérum sanguin à l'aide d'un diagnostic antigénique érythrocytaire connu ;
• détecter et identifier un virus inconnu à l'aide d'un diagnostic d'anticorps érythrocytaire connu.

Avantages du RNGA : haute sensibilité, simplicité de la technique de réglage et réponse rapide.

Cependant, il est important de noter qu'il existe de grandes difficultés dans la préparation de diagnostics d'érythrocytes stables (grande dépendance à la pureté des composants utilisés, nécessité de sélectionner un mode de fixation, tanisation et sensibilisation des érythrocytes pour chaque type de virus).

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Il utilise des érythrocytes ou des matériaux synthétiques neutres (par exemple des particules de latex), à la surface desquels sont adsorbés des antigènes (bactériens, viraux, tissulaires) ou des anticorps.

Leur agglutination se produit lorsque les sérums ou antigènes appropriés sont ajoutés. Les érythrocytes sensibilisés avec des antigènes sont appelés érythrocytes antigéniques diagnosticum et sont utilisés pour détecter et titrer les anticorps. Erythrocytes sensibilisés aux anticorps. sont appelés immunoglobulines érythrocytaires diagnosticum et sont utilisés pour détecter les antigènes.

La réaction d'hémagglutination passive est utilisée pour diagnostiquer des maladies causées par des bactéries (fièvre typhoïde et paratyphoïde, dysenterie, brucellose, peste, choléra, etc.), des protozoaires (paludisme) et des virus (grippe, infections à adénovirus, hépatite virale B, rougeole, encéphalite à tiques, fièvre hémorragique de Crimée, etc.), ainsi que pour déterminer certaines hormones, pour identifier l'hypersensibilité du patient aux médicaments et aux hormones, telles que la pénicilline et l'insuline.

Réaction d'hémagglutination passive (RPHA).

La réaction d'hémagglutination passive est une méthode sensible de diagnostic sérologique et est utilisée à la fois pour le diagnostic précoce et rétrospectif, ainsi que pour déterminer l'état immunopogique du vacciné. Chez les patients atteints de tularémie, les anticorps sont généralement détectés à la fin de la 1ère ou de la 2ème semaine de la maladie, après 1-1,5 mois, les titres de RPHA atteignent des valeurs maximales (1 : 100000-1 : 20 000, moins souvent plus haut), après dont ils diminuent au niveau 1 : 100-1 : 200 sont stockés pendant une longue période.

Chez les vaccinés, les anticorps sont également constamment détectés, cependant, à des titres inférieurs, ne dépassant pas 1: 2000-1: 5000 1-1,5 mois après la vaccination, ils restent pendant plusieurs années à un faible niveau de 1: 20-1: 80.

La tularémie érythrocytaire diagnosticum (antigénique) est utilisée comme antigène pour la fixation de la RPHA.

Le médicament est un érythrocytes de mouton formalinisés sensibilisés à l'antigène de la tularémie, produit sous forme liquide et sèche. Préparation liquide - une suspension à 10% d'érythrocytes dans une solution de formol à 10%. Préparation sèche lyophilisée - suspension d'érythrocytes séchée sous vide à 10 % sans conservateur. Avant utilisation, il est dilué selon les instructions sur l'étiquette. Pour régler la réaction dans des plaques de polystyrène, les deux médicaments sont utilisés à une concentration de 2,5% et lors de la configuration de la réaction en microvolumes - à une concentration de 0,5%.

Technique de mise en scène RPGA.

Les sérums testés sont dilués avec de la solution physiologique 1:5 (1:10) et chauffés à 56°C pendant 30 minutes.

Réaction d'hémagglutination (RHA) et

Ensuite, afin d'éliminer les anticorps hétérogènes contre les érythrocytes d'agneau, les sérums sont traités avec une suspension à 50 % d'érythrocytes d'agneau formalisés. Pour cela, des érythrocytes sont ajoutés à raison de 2 gouttes (0,05 ml chacune) pour 1 ml de sérum et soigneusement mélangés par agitation.

Le sérum est laissé jusqu'à ce que les érythrocytes soient complètement déposés, ou centrifugé après une heure à température ambiante, après quoi il est prêt pour la recherche.

Le liquide de dilution est versé dans un volume de 0,5 ml dans une rangée de trous d'une plaque de polystyrène.

Dans une étude préalable des sérums, il est conseillé de les tester en réglant la réaction dans une rangée courte de la plaque (6 puits). Si des anticorps sont détectés dans une rangée courte, les sérums sont retestés dans une rangée de dilution longue (12 puits).

Après avoir renversé le liquide de dilution, ajouter 0,5 ml des sérums testés à une dilution de 1: 5 dans le premier puits de chaque rangée (court ou long). Puis, dans les mêmes volumes de sérum, titrer avec des dilutions au double. Ainsi, des dilutions de sérum sont obtenues dans la série courte de 1:10 à 1:320, et dans la série longue de 1:10 à 1:20480. Après titrage des sérums, une goutte (0,05 ml) d'une suspension de travail à 2,5 % d'érythrocytes sensibilisés est ajoutée dans chaque puits.

Le contenu des plaques est bien agité jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène. Les plaques sont laissées à température ambiante sur une surface de table fixe. Un enregistrement préliminaire de la réaction est effectué après 2-3 heures, la détermination finale du titre est effectuée après sédimentation complète des érythrocytes dans les puits. Les témoins suivants sont fournis pour la réaction : 1) le sérum à tester à une dilution de 1:10 dans un volume de 0,5 ml + 1 goutte d'une suspension à 2,5 % d'érythrocytes non sensibilisés ; 2) liquide de dilution dans un volume de 0,5 ml + 1 goutte de suspension à 2,5% d'érythrocytes non sensibilisés ; 3) liquide de dilution dans un volume de 0,5 ml + 1 goutte de suspension à 2,5% d'érythrocytes sensibilisés.

Tous les contrôles doivent être clairement négatifs.

Comptabilité et évaluation de RPGA. La réaction est évaluée selon le schéma suivant :

1) une réaction fortement positive (++++) - les érythrocytes tombent au fond du trou en une couche uniforme sous la forme d'un "parapluie", qui a souvent des bords festonnés;

2) réaction positive (+++) - les globules rouges recouvrent au moins les 2/3 du fond du puits ;

3) une réaction faiblement positive (++) - l'agglutinat est petit et situé au centre même du trou;

4) une réaction douteuse (+) - il y a des grains séparés d'agglutinat autour du sédiment érythrocytaire au centre même du trou;

5) négatif (-) - au fond du trou, les érythrocytes se déposent sous la forme d'un "bouton" ou d'un petit anneau aux bords lisses et bien définis.

Le titre sérique est pris en compte en fonction de la dernière dilution de sérum, qui a donné une réaction assez nette (au moins trois plus).

Une dilution de 1: 100 et plus est considérée comme un titre diagnostique, cependant, comme dans le cas de la PR, il est nécessaire de surveiller son augmentation.

La RPHA dans la tularémie est assez spécifique et ne montre des réactions croisées qu'avec les sérums de brucellose. Diagnostic différentiel possible par la hauteur des titres en RPHA, qui sont significativement plus élevés avec un antigène homologue.

Technique de mise en RPGA en microvolumes.

La RPGA peut être réalisée en microvolumes à l'aide d'un microtitrage de type Takachi (ou plaques de microtitration à fond rond avec micropipettes), qui permet le titrage de matériel dans des volumes de 25 l et 50 l. La technique de mise en place des réactions, l'enchaînement de toutes les opérations est le même que dans l'étude en plaques de polystyrène. Cependant, il convient de garder à l'esprit que la sensibilité de la microméthode est généralement d'une dilution (c'est-à-dire

2 fois) inférieur à la méthode macro.

Pour mettre en place la réaction en microtitration, un liquide de dilution dans un volume de 50 µl est ajouté dans chaque puits à l'aide d'une pipette compte-gouttes. Puis, à l'aide de titreurs à tête de 50 µl, le sérum à tester est prélevé en y plongeant la tête.

Assurez-vous que le liquide a rempli la tête du titreur. Transférer le titreur avec sérum dans le premier puits et, en le maintenant en position verticale, effectuer plusieurs mouvements de rotation dans les deux sens. Ensuite, le titreur est transféré dans le puits suivant et la manipulation est répétée. Le titrage peut être effectué simultanément sur plusieurs rangées. Après avoir titré toute la rangée, le titreur est lavé à l'eau distillée (avec un changement de 2 portions) par mouvements rotatifs, l'eau est retirée de la tête à l'aide d'un écouvillon et brûlée sur la flamme du brûleur.

Après titrage, ajouter 25 l de diagnostic érythrocytaire dans les puits.

La concentration de diagnosticum pour RPHA dans les microvolumes doit être de 0,5% (c'est-à-dire que la suspension d'érythrocytes à 2,5% est en outre diluée 5 fois). Après avoir ajouté les érythrocytes, les plaques doivent être agitées doucement jusqu'à l'obtention d'une suspension homogène. Les résultats peuvent être enregistrés en 1 à 1,5 heures, ce qui est un avantage significatif du RPHA dans un microtitrage.

De plus, cette technique nécessite une petite quantité de tous les ingrédients de la réaction et des sérums à tester.

La réaction est prise en compte selon le schéma suivant :

1) "+" - hémagglutination à part entière, dans laquelle les érythrocytes tombent au fond du trou dans une couche uniforme sous la forme d'un "parapluie" occupant au moins les 2/3 du fond;

2) "+ -" - hémagglutination partielle, dans laquelle les érythrocytes tombent au fond sous la forme d'un anneau lâche de petite taille;

3) "-" - absence d'hémagglutination, lorsque les érythrocytes tombent au fond sous la forme d'un petit bouton ou d'une boucle à bord régulier.

La spécificité d'un résultat positif obtenu en RPHA peut être vérifiée à l'aide d'une réaction à trois composants - la réaction passive d'inhibition de l'hémagglutination (RPHA).

Technique de mise en scène du RTPGA.

Cette réaction permet de confirmer la spécificité d'un résultat RPHA positif lorsqu'il est discutable ou d'intérêt épidémiologique particulier. Le mécanisme réactionnel consiste en une inhibition spécifique de l'hémagglutination lorsqu'une suspension de bactéries tularémiques tuées est ajoutée au sérum à tester. Trois composants interagissent dans la réaction : le sérum testé, l'antigène spécifique de la tularémie et l'antigène érythrocytaire diagnosticum RTPHA sont généralement placés dans une rangée de 7 à 8 puits.

Il est conseillé d'installer un RPGA répété en parallèle avec le RTPHA. 0,25 ml du liquide de dilution est versé dans deux rangées de puits, puis le sérum à tester dans un volume de 0,25 ml est ajouté dans les premiers puits des deux rangées et titré.Deux séries identiques de dilutions de sérum sont obtenues. Ajouter 0,25 ml de liquide de dilution dans tous les puits de la deuxième rangée et 0,25 ml de suspension de bactéries tularémiques dans les puits de la première rangée.

On utilise la tularémie diagnosticum (contenant 25 milliards de bactéries tularémiques dans 1 ml), préalablement diluée 50 fois.

Cette suspension contient 500 millions de bactéries dans 1 ml ou 125 millions dans un volume de 0,25 ml. Après avoir ajouté l'antigène, la plaque est laissée pendant 1 heure à température ambiante, après quoi une goutte (0,05 ml) d'érythrocytes diagnosticum est ajoutée à tous les puits des deux rangées, la plaque est secouée et laissée sur une surface de table plane.

La comptabilité est effectuée en 2-3 heures.

Comptabilité et évaluation du RTPHA. Si le sérum à tester contient des anticorps spécifiques de la tularémie, ils sont neutralisés par l'antigène ajouté et l'hémagglutination ne se produira pas dans la première rangée de puits, ou, avec un titre sérique élevé, l'hémagglutination sera notée dans un nombre plus petit (de 2-4) de puits que dans la rangée avec RPHA. Dans ce cas, la spécificité des résultats est confirmée.

Si une hémagglutination est notée dans les deux rangées, c'est-à-dire les résultats du RTPHA et du RPHA coïncident, ceci indique l'absence d'anticorps anti-tularémie dans le sérum testé. Dans ce cas, le résultat principal de la RPHA est reconnu comme non spécifique.

Technique de mise en RTPGA en microvolumes. Le RTPHA, ainsi que le RPHA, peuvent être réalisés en microvolumes à l'aide d'un microtitre de type Takachi.

Pour ce faire, 0,25 µl d'un liquide de dilution est introduit dans les puits des microplaques en deux rangées de 7-8 puits chacune. Ensuite, à l'aide d'un titreur, 0,25 µl de sérum à tester est noté et titré sur les deux rangées. Après cela, 25 l d'antigène de la tularémie (dont la concentration est de 500 millions de bactéries de la tularémie dans 1 ml) sont ajoutés à chaque puits de la première rangée et 25 l de liquide de dilution sont ajoutés à la deuxième rangée.

Les plaques sont laissées 1 heure à température ambiante, après quoi 25 µl de spectrocyte diagnosticum antigénique (concentration 0,5 %) sont ajoutés dans tous les puits des deux rangées.

Les résultats sont pris en compte et évalués de manière similaire à la réaction en macro-volumes.

Date de publication : 2015-02-03 ; Lire : 3176 | Violation du droit d'auteur de la page

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La réaction d'inhibition de l'hémagglutination (RTGA) est une méthode d'identification d'un virus ou de détection d'anticorps antiviraux dans le sérum sanguin du patient, basée sur le phénomène d'absence d'agglutination des érythrocytes par un médicament contenant un virus en présence de sérum immunisé contre celui-ci.

La réaction d'inhibition de l'hémagglutination (RTGA) est basée sur le blocage, la suppression des antigènes viraux par les anticorps de l'immunsérum, à la suite de laquelle les virus perdent leur capacité à agglutiner les érythrocytes.

Le RTGA est utilisé pour diagnostiquer de nombreuses maladies virales dont les agents responsables (virus de la grippe, de la rougeole, de la rubéole, de l'encéphalite à tiques, etc.) peuvent agglutiner les érythrocytes de divers animaux.

Mécanisme. Le typage du virus est réalisé dans la réaction d'inhibition de l'hémagglutination (RTGA) avec un ensemble de sérums spécifiques de type. Les résultats de la réaction sont pris en compte pour l'absence d'hémagglutination.

Les sous-types de virus A avec les antigènes H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 et autres peuvent être différenciés en RTGA avec un ensemble de sérums homologues spécifiques au type.

Réaction de liaison du complément. Mécanisme. Composants. Application

La réaction de liaison du complément (CSC) est que lorsque les antigènes et les anticorps se correspondent, ils forment un complexe immun auquel le complément (C) est attaché par le fragment Fc des anticorps, c'est-à-dire que le complément est lié par un antigène-anticorps. complexe. Si le complexe antigène-anticorps ne se forme pas, le complément reste libre.

L'interaction spécifique de AG et AT s'accompagne d'une adsorption (liaison) du complément. Le processus de fixation du complément ne se manifestant pas visuellement, J. Bordet et O. Zhangu ont suggéré d'utiliser le système hémolytique (érythrocytes de mouton + sérum hémolytique) comme indicateur, qui montre si le complément est fixé par le complexe AG-AT. Si AG et AT se correspondent, c'est-à-dire qu'un complexe immun se forme, alors le complément est lié par ce complexe et l'hémolyse ne se produit pas. Si AT ne correspond pas à AH, alors le complexe ne se forme pas et le complément, tout en restant libre, se connecte au second système et provoque une hémolyse.

Composants. Le test de fixation du complément (CSC) est une réaction sérologique complexe. Pour sa mise en œuvre, 5 ingrédients sont nécessaires, à savoir : AG, AT et complément (premier système), érythrocytes de mouton et sérum hémolytique (deuxième système).

L'antigène pour le CSC peut être des cultures de divers micro-organismes tués, leurs lysats, des composants de bactéries, des organes pathologiquement altérés et normaux, des lipides tissulaires, des virus et des matériaux contenant des virus.

Le sérum de cobaye frais ou sec est utilisé en complément.

Mécanisme. La RSK est réalisée en deux phases : 1ère phase - incubation d'un mélange contenant les trois composants antigène + anticorps + complément ; 2ème phase (indicateur) - détection du complément libre dans le mélange en y ajoutant un système hémolytique composé d'érythrocytes de mouton et de sérum hémolytique contenant des anticorps contre eux. Dans la 1ère phase de la réaction, lorsque le complexe antigène-anticorps est formé, le complément est lié par celui-ci, puis dans la 2ème phase, l'hémolyse des érythrocytes sensibilisés par les anticorps ne se produira pas ; la réaction est positive. Si l'antigène et l'anticorps ne correspondent pas (il n'y a pas d'antigène ou d'anticorps dans l'échantillon à tester), le complément reste libre et dans la 2ème phase il va rejoindre le complexe érythrocytes-anticorps anti-érythrocytes, provoquant une hémolyse ; la réaction est négative.

Application. La RSK est utilisée pour diagnostiquer de nombreuses maladies infectieuses, en particulier la syphilis (réaction de Wasserman).

ELISA en phase solide- une variante du test, lorsqu'un des composants de la réponse immunitaire (antigène ou anticorps) est sorbé sur un support solide, par exemple, dans les puits de plaques de polystyrène. Les composants sont détectés par l'ajout d'anticorps ou d'antigènes marqués. Si le résultat est positif, la couleur du chromogène change. Chaque fois après l'ajout du composant suivant, les réactifs non liés sont retirés des puits par lavage,

I. Lors de la détermination des anticorps (figure de gauche), le sérum sanguin du patient, le sérum antiglobuline marqué par une enzyme et le substrat / chromogène de l'enzyme sont ajoutés séquentiellement aux puits des plaques contenant l'antigène sorbé.

II. Lors de la détermination de l'antigène (figure de droite), l'antigène est introduit dans les puits avec des anticorps adsorbés (par exemple, du sérum sanguin avec l'antigène souhaité), le sérum de diagnostic contre celui-ci et des anticorps secondaires (contre le sérum de diagnostic) marqués avec l'enzyme sont ajouté, puis le substrat/chromogène pour l'enzyme.

ELISA compétitif pour déterminer les antigènes : l'antigène cible et l'antigène marqué enzymatiquement entrent en compétition pour lier un nombre limité d'anticorps de l'immunsérum.

Un autre test est l'ELISA compétitif pour la détermination des anticorps : les anticorps cibles et les anticorps marqués par une enzyme entrent en compétition pour les antigènes adsorbés sur la phase solide.

Immunobuvardage- une méthode très sensible de détection de protéines basée sur une combinaison d'électrophorèse et d'ELISA ou RIA. L'immunobuvardage est utilisé comme méthode de diagnostic pour l'infection par le VIH, etc.

Les antigènes pathogènes sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide, puis transférés du gel sur papier activé ou sur membrane de nitrocellulose et développés par ELISA. Les entreprises produisent de telles bandes de transfert d'antigène. Le sérum du patient est appliqué sur ces bandelettes. . Ensuite, après incubation, les anticorps non liés du patient sont lavés et le sérum contre les immunoglobulines humaines marquées avec l'enzyme est appliqué . Le complexe formé sur la bandelette [antigène + anticorps du patient + anticorps contre les Ig humaines] est détecté en ajoutant un substrat chromogène qui change de couleur sous l'action d'une enzyme.